石榴酒發(fā)酵過程中香氣動態(tài)變化規(guī)律

唐柯，王茜，周霞，金杰，徐巖*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(安徽乳泉酒業(yè)有限公司，安徽 懷遠(yuǎn)，233400)

石榴(PunicagranatumL.)系石榴科石榴屬，落葉灌木或小喬木，果實富含糖類、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，有溫補、軟化血管、降低血糖、血脂以及延緩衰老之功效[1]。石榴在我國已有兩千多年的栽培歷史，安徽是我國石榴五大主要產(chǎn)區(qū)之一，猶以安徽懷遠(yuǎn)的玉石籽、紅瑪瑙、大笨子、青皮糙等聞名[2]。石榴酒是以石榴為原料經(jīng)破碎、榨汁、低溫發(fā)酵、陳釀老熟而成，果香濃郁、口味酸飴、酒體醇厚的低度果酒，備受人們青睞[3-4]。石榴果酒酒精度低，營養(yǎng)價值高，風(fēng)味獨特，成為提高石榴附加值、石榴深加工的首選方向[5]，同時也積極響應(yīng)國家釀酒行業(yè)提出的“高度酒向低度酒轉(zhuǎn)變”、“蒸餾酒向釀造酒轉(zhuǎn)變”、“糧食酒向果露酒轉(zhuǎn)變”的倡導(dǎo)。石榴酒不僅風(fēng)格獨特，更具有豐富的營養(yǎng)價值，以及較高的保健作用，符合現(xiàn)代人們追求高質(zhì)量生活的要求，市場潛力巨大。風(fēng)味是決定酒類品質(zhì)的核心因素[6-8]，因此對風(fēng)味物質(zhì)的剖析也是實現(xiàn)石榴酒風(fēng)味調(diào)控、品質(zhì)提高的基礎(chǔ)。

目前國內(nèi)外對于石榴酒相關(guān)研究已逐漸展開，ANDREU-SEVILLA等對石榴汁和石榴酒中揮發(fā)性化合物進(jìn)行測定分析，發(fā)現(xiàn)在石榴汁中，萜烯類的檸檬烯是最豐富的揮發(fā)性化合物，而葡萄酒的揮發(fā)性成分則大不相同，辛酸乙酯明顯占主導(dǎo)地位[9]。WASILA等研究了石榴皮對果汁及酒感官、多酚組成和抗氧化能力的影響，結(jié)果表明，帶皮榨汁使果汁變苦變澀，但對石榴酒的感官品質(zhì)有較好的改善作用，此外果皮可以貢獻(xiàn)更多的總酚以及類黃酮[10]。而國內(nèi)的研究大多側(cè)重于對石榴酒工藝、抗氧化及功能成分方面的研究，如張憲宇[11]對石榴酒發(fā)酵工藝進(jìn)行初探，研究了酵母的選擇、加糖和果汁的澄清等，并且釀造出了石榴發(fā)酵酒；劉月永等[12]在對釀酒酵母的選擇、發(fā)酵溫度以及SO2的添加這類研究的基礎(chǔ)上，釀制出了體積分?jǐn)?shù)12%的干型石榴酒；唐虎利等13]以石榴為原料，采用短時浸漬控溫發(fā)酵生產(chǎn)石榴發(fā)酵酒，再將其加工，得到了石榴干紅酒；杜琨等[14]采用石榴果全汁低溫發(fā)酵，并研究了其發(fā)酵溫度、時間等，釀造出了低度的石榴果酒；田曉菊等[15]研究了影響石榴酒在發(fā)酵過程中甲醇和雜醇油生成量的影響因素，發(fā)現(xiàn)在相同條件下，甜石榴汁不僅比酸石榴汁會發(fā)酵得徹底，而且其中甲醇、雜醇油的含量也比酸石榴汁高；甲醇和雜醇油的含量與發(fā)酵溫度呈現(xiàn)正相關(guān)性。而有關(guān)風(fēng)味物質(zhì)特別是石榴酒釀造過程中的香氣動態(tài)變化規(guī)律則鮮有人探究[16]。

因此，本課題以安徽懷遠(yuǎn)紅瑪瑙石榴為試材，采用SPME結(jié)合GC-MS，對紅瑪瑙石榴酒發(fā)酵過程不同時期香氣成分進(jìn)行測定分析，研究石榴果酒釀制過程中香氣物質(zhì)組成的變化，以及香氣成分的動態(tài)變化規(guī)律，以期為石榴果酒釀造工藝的進(jìn)一步改進(jìn)以及發(fā)酵過程中的風(fēng)味控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴樣品由安徽乳泉酒業(yè)有限公司提供，品種為紅瑪瑙石榴。石榴酒發(fā)酵期間樣品：從加入酵母起，每隔24 h取樣1次，直至發(fā)酵結(jié)束。

2-辛醇、甲醇、二氯甲烷(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；無水NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、偏重硫酸鉀(分析純)，上海國藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；固相萃取裝置，美國Supelco公司；GC 6890N-MSD 5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；DB-FFAP毛細(xì)管柱，美國Agilent公司；DC-12型氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 石榴酒的釀制

工藝流程：

石榴→清洗去皮→壓榨取汁→澄清殺菌(偏重硫酸鉀，60 mg/L)→接種酵母(D254, LAFFORT)→控溫發(fā)酵(26～28 ℃)→過濾裝瓶→石榴酒

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

總糖、總酸、pH、酒精度的測定參照GB/T15038—2006進(jìn)行[17]。

1.3.3 萃取方法及儀器條件

檢測方法在MA等[18]的方法上稍作變動。采用固相微萃取三相頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)來吸附香氣化合物。取8 mL石榴酒樣品置于20 mL頂空樣品瓶中，加入3 g NaCl。在50 ℃下預(yù)熱平衡5 min， 隨后打開電磁攪拌器，將轉(zhuǎn)速調(diào)至400 r/min，插入刻度調(diào)至2.0的萃取頭，攪拌萃取45 min。

GC運行條件：樣品經(jīng)過DB-FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm I.D.，0.25 μm)分離；進(jìn)樣口的溫度為250 ℃， 不分流；載氣為He，流速為2 mL/min；柱溫升溫程序：初始溫度為50 ℃，穩(wěn)定2 min后，以6 ℃/min的速率升溫至 230 ℃，并保持15 min。分離后的樣品，經(jīng)過MSD5975檢測。

MS運行條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度為 230 ℃，掃描范圍設(shè)定30.00～500.00 amu。每個樣品重復(fù)測定3次，取均值。

1.3.4 物質(zhì)定性與相對定量

物質(zhì)定性：香氣活性成分的定性，通過與NIST 05質(zhì)譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行檢索比對，并根據(jù)改進(jìn)的Kovats法計算得到各物質(zhì)保留指數(shù)(RI)進(jìn)行確認(rèn)[19]。

組分峰面積的相對含量：在頂空瓶的待測樣品中加入內(nèi)標(biāo)(2-辛醇，100 mg/L)，進(jìn)行GC-MS分離。計算如公式(1)。

(1)

式中：Xi-待測物質(zhì)相對含量；Cs-內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度；Ai-待測物質(zhì)峰面積；As-內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化指標(biāo)的測定

對發(fā)酵前后石榴汁及石榴酒理化指標(biāo)進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明(表1)，發(fā)酵前石榴汁的總糖為(121.97±1.56)g/L，pH為4.21，總酸(以檸檬酸計)為(5.97±0.23) g/L；發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)墙禐?2.05±0.17) g/L，從殘?zhí)呛靠梢钥闯霭l(fā)酵順利，達(dá)到了干型石榴果酒的要求。酒精度為(6.60±0.32)%(體積分?jǐn)?shù))，總酸為(6.52±0.31) g/L，發(fā)酵過程中酸度略有增加，與前人的研究結(jié)果基本一致[20]。

表1 石榴(汁)酒理化指標(biāo)分析Table 1 Analysis of physical and chemical indexes of pomegranate wine (juice)

2.2 石榴酒釀制過程中香氣動態(tài)變化規(guī)律分析

采用質(zhì)譜譜庫、保留指數(shù)比對的方法，鑒定出石榴酒發(fā)酵過程中游離態(tài)揮發(fā)性化合物的情況，香氣化合物及其相對定量詳見表2。

在石榴酒發(fā)酵全過程中，共檢測出123種揮發(fā)性化合物。石榴酒發(fā)酵過程中，揮發(fā)性化合物各類型化合物的檢出數(shù)量見表3。其中，發(fā)酵初始(石榴汁)共檢出25種，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行檢出的揮發(fā)性化合物種類也隨之增加。發(fā)酵第1天共檢出29種，發(fā)酵第2天共檢出44種，發(fā)酵第3天共檢出55種，發(fā)酵第4天共檢出59種，發(fā)酵第5天共檢出64種，發(fā)酵第6天共檢出62種，發(fā)酵第7天共檢出67種，發(fā)酵第8天共檢出67種。即從發(fā)酵第1天開始，揮發(fā)性化合物種類不斷增加，在發(fā)酵第5天時，揮發(fā)性化合物種類可以檢測到64種，隨后基本趨于穩(wěn)定一直到發(fā)酵結(jié)束。由表3可以看出，發(fā)酵結(jié)束時酯類物質(zhì)的種類最多，為34種，占到了總檢出個數(shù)的53%，其次是醇類物質(zhì)，共檢出14種。本研究的結(jié)果也與李美萍等的研究結(jié)果基本一致，李美萍等采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析石榴酒中揮發(fā)性化合物，總共確定了67種揮發(fā)性化合物，其中酯類物質(zhì)23種，醇類物質(zhì)16種[21]。

表4是石榴酒發(fā)酵過程中各類型化合物相對定量，醇、酸、酯三大類物質(zhì)基本都是隨著發(fā)酵的進(jìn)行含量也隨之增加，特別是發(fā)酵第3天，酯類物質(zhì)含量較之前顯著增加，最終從發(fā)酵初始的163.09 μg/L上升到發(fā)酵結(jié)束后的1 928.48 μg/L，相對含量增加了將近12倍。酯類物質(zhì)中，乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯相對含量均有顯著增加。醇類、酸類物質(zhì)的含量也線性上升，醇類物質(zhì)總量從發(fā)酵初始的282.94 μg/L升至發(fā)酵第8天的1 540.29 μg/L。醛類、酮類、烷烴類等揮發(fā)性化合物在整個發(fā)酵過程中，相對含量顯著降低。LAN等對石榴酒發(fā)酵過程中風(fēng)味及抗氧化活性變化進(jìn)行研究，他們發(fā)現(xiàn)風(fēng)味質(zhì)量的主要變化發(fā)生在發(fā)酵初期，特別是發(fā)酵0～4 d，發(fā)酵顯著降低了醛、酮、雜環(huán)和芳香族化合物的相對含量，但促進(jìn)了酯類和醇類的生成。本研究結(jié)果與之基本一致[22]。

此外，在石榴酒中還檢測到一類比較重要的香氣物質(zhì)—萜烯類物質(zhì)。萜烯類化合物通常含量不高但是閾值較低，對香氣的貢獻(xiàn)很大，代表著水果的品種香[23]。由表3、表4可以看出，萜烯類化合物雖然總量上較發(fā)酵初始相差不大，但是種類上明顯增加。石榴汁中只檢測到β-蒎烯1種萜烯，而發(fā)酵結(jié)束后檢測到了香茅醇、α-萜品醇、檸檬烯等6種萜烯類化合物。萜烯類化合物在水果中通常都是以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在的[24]，在發(fā)酵過程中通過酶解或者酸解釋放成可以感知的游離態(tài)香氣物質(zhì)[25]。

表2 石榴酒發(fā)酵過程中的揮發(fā)性香氣化合物及其相對定量 單位：μg/L

續(xù)表2

續(xù)表2

注：RI-計算出的保留指數(shù)；RIL-文獻(xiàn)中查閱出的保留指數(shù)；“-”，未檢測到。

表3 石榴酒發(fā)酵過程中各類型香氣化合物檢出數(shù)量Table 3 The quantity of different types of aroma compounds during pomegranate wine fermentation

表4 石榴酒發(fā)酵過程中各類型香氣化合物相對定量Table 4 The relative amount of different types of aroma compounds during pomegranate wine fermentation

3 結(jié)論

本課題采用SPME-GC-MS，對紅瑪瑙石榴發(fā)酵過程不同時期香氣成分進(jìn)行測定分析，研究石榴果酒釀制過程中香氣物質(zhì)組成的變化及動態(tài)變化規(guī)律。在石榴酒發(fā)酵過程中，很多來源于石榴汁中的香氣物質(zhì)發(fā)生了遷移，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，石榴酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物也愈發(fā)增加。在石榴酒發(fā)酵全過程中，共檢測出 123種揮發(fā)性風(fēng)味化合物。發(fā)酵初始(石榴汁)共檢出 25種，發(fā)酵第1天到發(fā)酵結(jié)束時第8天分別檢出 29、44、55、59、64、63、67、67種。在這些揮發(fā)性風(fēng)味化合物中，酯類物質(zhì)含量不斷增加，其中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯相對含量均有顯著增加。醇類物質(zhì)與酸類物質(zhì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，相對含量也快速增加；醛類、酮類、醚類、烷烴類等物質(zhì)相對含量則持續(xù)下降。此外，萜烯類化合物雖然總量上較發(fā)酵初始相差不大，但是種類上明顯增加。