超聲處理對豬皮明膠特性的影響

李雪晗，郭婷,2，余永,2，張宇昊,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(西南大學(xué)，國家食品科學(xué)與工程實驗教學(xué)中心，重慶，400715)

明膠由動物皮膚、骨、肌膜、肌腱等結(jié)締組織中的膠原部分降解而成，屬于大分子的親水膠體，可溶于熱水，可形成熱可逆性凝膠。明膠作為食品添加劑廣泛應(yīng)用到各類食品之中，如可添加到酒類中作為澄清劑、可添加到肉制品中作為增稠劑和膠凝劑、亦可添加到分散體系中作為穩(wěn)定劑[1]。食品體系中的電解質(zhì)、酸堿性、糖類物質(zhì)及外源物理處理如紫外照射、微波等均會影響明膠的黏度、凝凍強度和透射比[2]。

近年來，超聲波技術(shù)作為一種高速發(fā)展的新興技術(shù)，被各個領(lǐng)域所廣泛應(yīng)用。在食品加工過程中，超聲波技術(shù)主要應(yīng)用于食品加工的單一過程，例如在食品無損檢測及保鮮、乳液的乳化和均質(zhì)、超聲輔助完成的提取干燥殺菌過濾、肉的嫩化等方面[3-6]。巴西圣保羅大學(xué)的LUIS等[7]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理增加了重組熟制火腿的紅度值，并導(dǎo)致了肌原纖維產(chǎn)生微裂紋，并由此推斷超聲波在生產(chǎn)更健康的肉制品方面具有良好的潛力。此外，超聲波技術(shù)在蛋白質(zhì)改性方面也有較為普遍的應(yīng)用，其主要研究方向關(guān)于蛋白質(zhì)的水合作用、結(jié)構(gòu)變化以及加工特性。MADADLOU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白溶液經(jīng)過超聲處理后，形成凝膠的pH值降低，凝膠的彈性和強度增強。超聲處理可以增加蛋白溶解性，提高其乳化性，改善流變性能[9-10]。

由此可見不同的超聲處理可以改變蛋白的性質(zhì)，目前超聲波技術(shù)對明膠理化性質(zhì)與功能特性的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究，本實驗以豬皮明膠為原料，系統(tǒng)研究不同條件下超聲處理對明膠性質(zhì)影響規(guī)律，并結(jié)合明膠分子結(jié)構(gòu)的影響，分析超聲影響明膠性質(zhì)的分子機制，旨在為超聲波技術(shù)在含有明膠的食品體系中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬皮明膠(gelatin from porcine skin,V900863-500G)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(JA3003B)，上海精天電子儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101-4-S)，上海躍進醫(yī)療器械廠；溫控水浴鍋(8002)，北京永光明醫(yī)療儀器廠；質(zhì)構(gòu)儀(CT-3)，美國博勒飛公司；基礎(chǔ)電泳儀(Power Pac TM)，美國Bio-Rad公司；紅外光譜儀(Spectrun100)，美國Perkin Elmer公司；超聲波細胞破碎儀(JY92-IIDN型)，寧波新芝生物科技股份有限公司；流變儀(DHR-1)，美國TA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 明膠的超聲處理

配制66.7 g/L的明膠溶液30 mL，在60 ℃的恒溫水浴鍋中充分溶解后，快速放置于超聲波細胞粉碎儀中超聲處理，超聲處理基礎(chǔ)條件為超聲功率400 W，超聲時間10 min，超聲功率水平設(shè)置為為200、400、600 W，超聲時間水平設(shè)置為1、5、10、20 min 的12組實驗，每組實驗做3組平行。將做好的樣品60 ℃熱風(fēng)干燥24 h后放于干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 明膠強度分析

將樣品配成66.7 g/L的溶液，所得溶液放置于4 ℃的冰箱18 h后取出，立即采用質(zhì)構(gòu)儀測定其凝膠強度。測定參數(shù)為：探頭TA5，測試類型TPA分析，測試目標(biāo)為距離4 mm，觸發(fā)點負載5 g，測試速度1 mm/s。

1.3.3 明膠的亞基組成分析

采用SDS-PAGE垂直電泳分析明膠的亞基組成和分子質(zhì)量分布。質(zhì)量分數(shù)為6%的分離膠，質(zhì)量分數(shù)為5%的濃縮膠；電泳緩沖液為10×Tris-Glycine緩沖液(含0.25 mol/L Tris、1.92 mol/L Glycine、10 g/L SDS，稀釋10倍作內(nèi)槽電泳液)；5×樣品緩沖液(含250 mmol/L Tris-HCl(pH值6.8)、0.1 g/mL SDS、5 mg/mL BPB、0.5 mL/mL甘油、0.05 mL/mL 2-ME)；考馬斯亮藍R-250染色液(含1 g/L考馬斯亮藍R-250、 250 mL/L異丙醇、100 mL/L冰乙酸)和考馬斯亮藍染色脫色液(含100 mL/L冰乙酸、50 mL/L乙醇)。配制1.5 mg/mL的明膠溶液，按體積比4∶1添加5×樣品緩沖液，沸水浴，冷卻后上樣，上樣量為10 μL(marker上樣量為10 μL)。15 mA恒流電泳，待溴酚藍跑到分離膠中后，電流調(diào)至25 mA，電泳時間約1 h。 考馬斯亮藍染色后用脫色液脫色，多次更換脫色液直至背景脫凈。

1.3.4 流變特性分析

分別測定超聲處理前后明膠黏度、膠凝溫度和熔化溫度、儲能模量與損耗模量。

(1)明膠黏度特性分析

釆用DHR-1流變儀測定66.7 g/L的明膠溶液在40 ℃下黏度隨剪切速率的變化。

(2)明膠膠凝溫度和熔化溫度分析

釆用動態(tài)黏彈性法測定明膠的膠凝溫度和熔化溫度，以tan(d)=1作為膠凝和熔化的轉(zhuǎn)折點，定義其對應(yīng)的溫度為膠凝/熔化溫度。采用DHR-1流變儀測定6.67%的經(jīng)超聲處理的明膠樣品的黏彈性，設(shè)定溫度變化速率為1 ℃/min，控制應(yīng)力3.0 Pa，測試夾具40 mm A1平板，Peltier溫度控制系統(tǒng)，板間距為0.15 mm，明膠樣品溶化后于流變儀上溫度由40 ℃ 冷卻到5 ℃，在5 ℃下保持2 min，然后由5 ℃加熱到40 ℃，測定儲能模量(G′)和損耗模量(G″)隨溫度掃描的變化，得到相角(δ)。

(3)明膠模量分析

采用DHR-1流變儀測定樣品的凝膠性。DHR-1流變儀測定6.67%的經(jīng)超聲處理的明膠樣品的黏彈性，設(shè)定溫度變化速率為1 ℃/min，控制應(yīng)力3.0 Pa，測試夾具40 mmA1平板，Peltier溫度控制系統(tǒng)，板間距為0.15 mm，明膠樣品溶化后于流變儀上溫度由40 ℃冷卻到5 ℃，在5 ℃下保持2 min，然后由5 ℃加熱到40 ℃，測定儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。隨溫度掃描的變化測定時間為37 min。

1.3.5 紅外光譜分析

稱取經(jīng)不同超聲處理的干明膠1 mg分別與1 g溴化鉀(KBr)研磨均勻后，置于40 ℃下烘干一夜，取出壓片。用Spectrun100紅外光譜儀檢測紅外吸收，掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。 曲線擬合采用Origin 8.0，酰胺A帶、酰胺Ⅰ帶峰位置以及AⅢ/A1453的變化采用Perkin Elmer進行分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)3次，并計算出平均值以及標(biāo)準(zhǔn)方差來表示實驗結(jié)果。實驗數(shù)據(jù)均采用軟件Origin 8.0進行作圖，用軟件SPSS 20.0進行顯著性差異分析(P<0.05 及P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對明膠凝膠強度的影響

不同超聲條件處理后明膠凝膠強度變化趨勢如圖1所示，在不同超聲功率下，明膠凝膠的凝膠強度均隨處理時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，功率為200、400、600 W的時候明膠凝膠強度均在10 min時達到最大值，分別達到393 g、446 g和415 g，相比于未經(jīng)過任何處理的明膠樣品，分別提高了76.27%、67.21%、72.28%。

圖1 超聲波對明膠凝膠強度的影響Fig.1 Effect of ultrasound on gelatin gel strength注：用t檢驗法進行多重比較。同一曲線中標(biāo)有不同大寫字母、小寫字母者分別表示組間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。

這說明了適度超聲處理可以改善明膠凝膠特性。從超聲功率的角度分析，400 W處理后明膠凝膠強度最優(yōu)，其次是600 W處理，最后是200 W 處理，其變化趨勢與超聲時間對明膠凝膠強度的影響一致，說明適度超聲處理可以明顯改善明膠的凝膠強度，但超聲強度過大反而會導(dǎo)致明膠凝膠特性劣變。超聲波具有能量和波動的雙重效應(yīng)，一是空化效應(yīng)，即在液體介質(zhì)中表現(xiàn)為泡的形成、破裂以及伴隨的能量的釋放；二是介質(zhì)和容器也可以通過聲的吸收產(chǎn)生共振性質(zhì)的二級效應(yīng)，如機械效應(yīng)等。這些效應(yīng)可以破壞維系明膠結(jié)構(gòu)的氫鍵平衡，甚至可以破壞肽鍵[11]。

適度超聲處理可以提高明膠的凝膠強度，可能是因為該條件下空化效應(yīng)等作用并未斷裂明膠的肽鍵，保持了明膠亞基組分的完整性，但改變明膠的二級結(jié)構(gòu)，使明膠亞基展開，在凝膠形成過程中更易形成類三螺旋結(jié)構(gòu)，進而賦予明膠更好的凝膠特性。

2.2 超聲處理對明膠的亞基組成的影響

應(yīng)用SDS-PAGE電泳檢測不同超聲處理后的明膠樣品的亞基組成及分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖2所示，圖中可以清楚看到明膠的α1鏈、α2鏈以及β鏈。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 1-200 W 1 min； 2-200 W 5 min； 3-200 W 10 min；4-200 W 20 min； 5-400 W 1 min； 6-400 W 5 min； 7-400 W 10 min； 8-400 W 20 min； 9-600 W 1 min； 10-600 W 5 min； 11-600 W 10 min；12-600 W 20 min； 13-未經(jīng)處理的明膠樣品圖2 超聲處理對明膠分子質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on gelatin molecular weight

由圖2可知，超聲處理使明膠組分產(chǎn)生了一定的降解，但從SDS-PAGE圖譜中小分子組分的顏色分析，大部分處理后降解程度的差異并不明顯，這可能與電泳的分辨率有關(guān)。對于超聲強度較大的600 W 20 min處理組，可明顯看到其小分子組分明顯高于其他處理組，說明在較強超聲強度下，產(chǎn)生的空化效應(yīng)等會造成明膠亞基組分的降解，進而導(dǎo)致明膠凝膠特性劣變。此外，因為電泳的前處理過程中破壞了明膠亞基間的非共價鍵，因此無法判斷超聲處理是否促進了明膠亞基組分的聚集。因此擬通過流變學(xué)手段，進一步研究超聲處理后明膠亞基組分變化情況。

2.3 超聲處理對明膠黏度特性的影響

流體在有相對運動時產(chǎn)生內(nèi)摩擦力以抗形變是流體的一種固有物理屬性，稱為流體的黏性或黏滯性。不同超聲波預(yù)處理對明膠凝膠表觀黏度的影響如圖3所示。圖3表明在剪切速率為0～1 s-1，所有明膠樣品的黏度隨剪切速率的增加而降低，表現(xiàn)為剪切變稀，呈現(xiàn)假塑性流體的性質(zhì)[12]。黏度的降低主要是由于剪切過程中產(chǎn)生的物理作用力[13]，在剪切過程中，液體介質(zhì)在剪切、振蕩等作用下，最終形成蛋白質(zhì)之間的布朗運動和氫鍵被破壞的綜合作用[14]。當(dāng)剪切速率增加以克服布朗運動和分子間碰撞時，溶液在流動區(qū)域內(nèi)變得更加有序，且對流動的抵抗減弱，因此表現(xiàn)出較低的黏度[15-16]。

圖3 經(jīng)超聲波200 W、400 W、600 W處理對明膠凝膠表觀黏度的影響Fig.3 Effect of 200 W, 400 W, 600 W ultrasonic treatment on the apparent viscosity of gelatin gel

如圖3所示，經(jīng)超聲處理的明膠凝膠的黏度值基本高于空白值(即未經(jīng)過超聲處理的明膠)，因此推測超聲處理過程產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)等可能導(dǎo)致明膠亞基組分肽鏈展開，亞基氨基酸暴露，并通過氫鍵作用使亞基聚集體增加進而造成其對流動抵抗增強[17]。

總體來講，400 W處理后明膠的黏度值高于600 W 和200 W處理，證明黏度下降過程中400 W處理后的樣品中亞基組分間的互做更強，凝膠特性更好，與凝膠強度結(jié)果一致。

2.4 超聲處理對明膠溶液相位角的影響

相位角(tanσ)是耗能模量和儲能模量的比值稱為損耗角正切(tanσ=G″/G′)，表示黏彈性的度量，是蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成過程中的黏性和彈性的一個相對區(qū)分，即相位角越大，黏性越大，彈性越??；相位角越小，黏性越小，彈性越大[18]。因此，相位角的變化可以代表凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的類型，相位角越低，證明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越好[16,19]。經(jīng)超聲不同功率處理后的明膠溶液tanσ值隨溫度的變化趨勢如圖4所示，隨著溫度的降低，明膠溶液的tanσ值先增加，而后突然出現(xiàn)拐點，表明明膠出現(xiàn)了相變，隨后tanσ值隨著溫度的進一步降低迅速下降，說體系已經(jīng)由溶液變?yōu)槟z。

圖4 經(jīng)超聲波200 W、400 W、600 W處理后的明膠分別在冷卻過程中相角的變化Fig.4 The change of phase angle of gelatin treated by ultrasonic 200 W, 400 W and 600 W respectively during cooling

從明膠拐點的tanσ值看，空白組的tanσ值大于所有超聲處理組，說明在本研究所選擇的超聲處理條件下，明膠凝膠特性均得到一定程度改善；而且3個超聲功率下，每個組明膠拐點的tanσ最低值均為10 min處理樣品，說明其凝膠特性好于其他時間處理組，與凝膠強度結(jié)果一致。這主要是因為適度超聲所產(chǎn)生的空化效應(yīng)等改變了明膠的構(gòu)象，使之結(jié)構(gòu)適度展開，在后期凝膠形成過程中更有利于三螺旋結(jié)構(gòu)的形成。

2.5 超聲處理對明膠模量的影響

儲能模量G′可以用以衡量凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)彈性形變過程中的能量儲存，代表凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強度[8]。超聲波預(yù)處理對明膠凝膠儲能模量G′的影響如圖5所示。

a，b，c-冷卻；d，e，f-加熱圖5 超聲處理后的明膠在冷卻和加熱過程中儲能模量(G′)的變化Fig.5 Changes in storage modulus (G′) during cooling and heating of gelatin after sonication

由圖5可知，所有明膠樣品的G′都隨溫度的降低而升高，說明隨著溫度越低，明膠凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強度增大[20]。所有超聲處理的明膠凝膠樣品的儲能模量G′均高于未經(jīng)超聲處理的明膠樣品，再次證明本研究所選擇的超聲處理條件后，明膠凝膠特性均得到一定程度改善。從超聲功率的角度分析，400 W處理后樣品的G′最高，其次是600 W處理，200 W處理后明膠樣品的G′最低。說明400 W處理后明膠中亞基組分構(gòu)象變化更適合于類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成，使明膠凝膠特性體系中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強度更大，進而賦予了明膠更好的凝膠特性，與黏度結(jié)果分析一致。

2.6 紅外光譜分析

超聲波作用后的明膠紅外光譜掃描圖如圖6所示。各組明膠的酰胺A帶、酰胺Ⅰ帶的峰位置以及酰胺Ⅲ帶與1 457 cm-1處的峰峰強度比值變化趨勢如表1所示。

圖6 超聲處理后明膠的紅外光譜掃描圖Fig.6 Infrared spectra of gelatin after ultrasonic treatment

表1 超聲處理明膠紅外光譜中酰胺A帶峰位置、酰胺Ⅰ帶峰位置、AⅢ/A1453的變化Table 1 Ultrasonic treatment gelatin infrared spectrum amide A peak position, amideⅠpeak position, AⅢ/A1453changes

在3 430～3 440 cm-1的吸收峰被認為是酰胺A帶的譜帶，是N—H伸縮振動的吸收峰，表明分子內(nèi)氫鍵的存在。當(dāng)N—H參與氫鍵的形成時，酰胺A向低波數(shù)移動。超聲處理過的明膠酰胺A帶均向低波數(shù)移動，說明超聲處理后明膠中N—H參與的氫鍵均有所增加，這在明膠凝膠形成過程中更有利于類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成；這主要是因為明膠原有的氫鍵平衡在空化效應(yīng)等作用下發(fā)生改變，也是超聲處理后，明膠凝膠強度均有所增加的原因之一。不同超聲功率處理后，明膠中N—H參與形成的氫鍵變化差異不明顯，因此這不是造成不同超聲功率影響明膠凝膠特性差異的原因。

超聲過程中所產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)可以改變蛋白的構(gòu)象，破壞蛋白原有空間結(jié)構(gòu)，使蛋白展開[17]。酰胺Ⅲ與1 453 cm-1峰強度之比(AⅢ/A1453)，可以表征膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整度，比值越接近1表明膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整性越高[11]。由表1中數(shù)據(jù)可知，超聲處理均可造成明膠中三螺旋結(jié)構(gòu)的展開。從超聲時間角度分析，隨著超聲時間的延長，AⅢ/A1453值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且超聲10 min處理，均造成明膠中三螺旋結(jié)構(gòu)展開程度最大。明膠三螺旋結(jié)構(gòu)中亞基組分部分展開，可以使其在凝膠形成過程中有利于形成更多的類三螺旋結(jié)構(gòu)，賦予明膠更好的凝膠特性，這也是圖1中明膠凝膠強度最優(yōu)值均出現(xiàn)在10 min的原因。不同超聲功率下處理10 min時，AⅢ/A1453值的趨勢與明膠凝膠強度并不一致，這可能是因為，三螺旋結(jié)構(gòu)的展開程度并不是影響明膠凝膠強度的唯一因素，當(dāng)明膠三螺旋結(jié)構(gòu)展開超過一定程度后，其對明膠凝膠特性影響已經(jīng)不再明顯。

3 結(jié)論

(1)經(jīng)過超聲波處理后的明膠樣品的凝膠強度明顯高于未處理的空白樣品，但凝膠強度隨著超聲時間的增強和功率的增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，說明適度超聲處理可以明顯改善明膠的凝膠強度，但超聲強度過大反而會導(dǎo)致明膠凝膠特性劣變。其中處理時間10 min與處理功率400 W的條件處理后的明膠凝膠強度最優(yōu)。

(2)電泳分析表明，在本實驗所設(shè)置的超聲條件范圍內(nèi)對明膠進行超聲處理，明膠亞基組分并未發(fā)生明顯降解。

(3)流變學(xué)分析表明，400 W超聲處理后明膠的黏度增加明顯，說明在此條件下，超聲處理可能導(dǎo)致明膠亞基組分肽鏈展開，亞基氨基酸暴露，并通過氫鍵作用使亞基聚集體增加。明膠膠凝溫度與模量隨超聲條件變化趨勢與凝膠強度一致，說明400 W處理10 min 后明膠中亞基組分構(gòu)象變化更適合于類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成。

(4)紅外光譜分析表明，超聲處理后明膠中N—H參與的氫鍵有所增加，同時會導(dǎo)致明膠三螺旋結(jié)構(gòu)中的亞基組分部分展開，可以使其在凝膠過程中有利于形成更多的類三螺旋結(jié)構(gòu)，賦予明膠更好的凝膠特性。