龍血竭總黃酮對(duì)Kv1.3通道的調(diào)節(jié)作用

尹世金，張豐，鄒艷，王少兵，石書娟，龍思如，何回香，黎莉

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074；2 武漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，武漢430071)

機(jī)體正常的免疫反應(yīng)能有效抵御外界病原微生物的侵?jǐn)_，而當(dāng)機(jī)體免疫功能紊亂出現(xiàn)自身免疫抗原時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生自身抗體，通過破壞自身臟器組織引發(fā)多種自身免疫性疾病(AID).研究發(fā)現(xiàn)AID如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[2]、I型糖尿病[3]等患者體內(nèi)效應(yīng)記憶性T淋巴細(xì)胞(TEM)異常激活與增殖，激活的TEM細(xì)胞膜上電壓門控性鉀通道Kv1.3表達(dá)水平顯著上升，提示Kv1.3通道在AID發(fā)生中扮演了重要角色.而藥理學(xué)阻斷Kv1.3通道[1]或?qū)ζ溥M(jìn)行基因敲除[4]，均能對(duì)自身免疫性模型動(dòng)物產(chǎn)生良好的防治作用，揭示Kv1.3通道是開發(fā)治療AID先導(dǎo)藥物的新靶點(diǎn)[5].

中草藥為挖掘生物活性物質(zhì)提供了豐富資源，研究發(fā)現(xiàn)龍血竭能夠同時(shí)抑制經(jīng)典免疫反應(yīng)和補(bǔ)體替代免疫反應(yīng)[6]，抑制T細(xì)胞的異常激活與增殖，表現(xiàn)為較強(qiáng)的免疫抑制作用，這一作用與其濃度依賴性阻斷哺乳動(dòng)物Kv1.3通道功能有關(guān)[7]，也使從龍血竭中分離Kv1.3通道阻斷劑成為可能.但龍血竭成分復(fù)雜，含有黃酮類、萜類、酚類、甾體類等多種組分，前期研究發(fā)現(xiàn)龍血竭總黃酮是發(fā)現(xiàn)靶向離子通道蛋白生物活性物質(zhì)的重要組分[8]，因此本文擬提取龍血竭總黃酮，研究其對(duì)哺乳動(dòng)物Kv1.3通道功能的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步深入挖掘龍血竭中Kv1.3通道阻斷劑指明方向.

1 材料和方法

1.1 試劑與藥品

RPMI 1640、高糖型DMEM(Hyclone)；胎牛血清(FBS，Gibco)；Jurkat T 細(xì)胞、 HEK-293T細(xì)胞(武漢大學(xué)典藏中心)；乙酸乙酯(上海生工)；lipofectamine 2000(Invitrogen)；二甲基亞砜(DMSO,Biosharp)；細(xì)胞內(nèi)外液試劑(Sigma)；龍血竭原材料(西雙版納藥業(yè)，批號(hào)Z20063472)，標(biāo)準(zhǔn)品龍血素B(上海純優(yōu)生物科技，批號(hào)119425-90-0)；電壓門控性鉀通道Kv1.1,Kv1.2,Kv1.3的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP由武漢大學(xué)李文鑫教授實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)(UEC1312028，上海美普達(dá))；CO2培養(yǎng)箱(Heal Force,HF160W)；膜片鉗放大器(EPC9/2，HEKA)；顯微操作器(MP225,Sutter)；程控玻璃電極拉制儀(05-E型)、玻璃微電極拋光儀(2002-C)、多通道快速微量程控給藥系統(tǒng)(MPS-2)均購(gòu)自武漢儀博公司；微電極玻璃毛細(xì)管(武漢微探科學(xué)儀器).

1.3 龍血竭總黃酮的提取和含量測(cè)定

龍血竭總黃酮(tFRD)采用課題組優(yōu)化的工藝進(jìn)行提取[9]，以乙酸乙酯為提取溶劑，10倍溶劑70 ℃下回流提取30 min，提取1次.提取物中總黃酮含量以龍血素B (LrB)為對(duì)照品，于紫外分光光度計(jì)277 nm處測(cè)量對(duì)照品及提取物吸光度，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算提取物中總黃酮的含量.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和通道蛋白的外源性表達(dá)

人白血病淋巴細(xì)胞系Jurkat T 細(xì)胞和 HEK-293T細(xì)胞分別培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640和 高糖型DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).將編碼有電壓門控性鉀通道Kv1.1,Kv1.2,Kv1.3的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，24 h后選用發(fā)綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行電生理測(cè)試.

1.5 細(xì)胞內(nèi)外液和龍血竭總黃酮工作液的配制

用于記錄電壓門控性鉀通道電流的細(xì)胞外液成分為：140 mmol/L NaCl ,5 mmol/L KCl,2 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,10 mmol/L HEPES,10 mmol/L D-Glucose,外液PH值用NaOH調(diào)至7.4，滲透壓用蔗糖調(diào)至310～320 mOs/L.電極內(nèi)液成分為：140 mmol/L KCl,1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,10 mmol/L HEPES,3 mmol/L Na2ATP，內(nèi)液滲透壓為280～290 mOsm/L，PH值以KOH調(diào)至7.2.提取的龍血竭總黃酮粉末用DMSO溶解后，以不同濃度配制在細(xì)胞外液中用于電生理實(shí)驗(yàn).

1.6 電生理實(shí)驗(yàn)

采用EPC9/2(HEKA)放大器進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，環(huán)境溫度控制在22～25 ℃，實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置、數(shù)據(jù)的采集和電壓刺激均通過Patch Master軟件完成.微電極玻璃毛細(xì)管經(jīng)程控玻璃電極拉制儀兩步拉制，經(jīng)玻璃微電極拋光儀拋光，灌注電極內(nèi)液后稍加正壓，入液電阻為2～5 MΩ.在全細(xì)胞記錄模式下將細(xì)胞膜電位鉗制在-60 mV，每20 s 給予400 ms步長(zhǎng)、+50 mV的去極化脈沖刺激以激活電壓門控性鉀通道電流.待電流穩(wěn)定后，采用多通道快速微量程控給藥系統(tǒng)對(duì)所記錄細(xì)胞依次進(jìn)行濃度梯度給藥，同時(shí)記錄細(xì)胞膜上通道電流變化情況.

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 龍血竭提取物中總黃酮的質(zhì)量鑒定

將龍血素B對(duì)照品溶液和龍血竭提取物樣品溶液于220～600 nm處進(jìn)行連續(xù)波長(zhǎng)掃描，獲得紫外吸收?qǐng)D譜如圖1A所示，可知龍血竭提取物的紫外吸收曲線與對(duì)照品龍血素B基本一致，二者均在277 nm處有明顯的吸收峰，與以往報(bào)道一致[9]，表明龍血竭總黃酮提取成功.

將對(duì)照品龍血素B進(jìn)行濃度梯度檢測(cè)，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD277為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合直線回歸方程(圖1B)，算得提取物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65.12%，與報(bào)道基本一致[9]，滿足《藥品注冊(cè)管理辦法》之中藥5類新藥的植物藥提取有效部位的含量要求，可用于進(jìn)一步的藥理學(xué)活性測(cè)定.

A)龍血竭總黃酮和龍血素B的全波長(zhǎng)紫外吸收?qǐng)D譜； B)龍血素B的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1 龍血竭提取物中總黃酮的質(zhì)量鑒定Fig.1 Quality identification of total flavonoids from the extract of Resina Draconis

2.2 龍血竭總黃酮對(duì)內(nèi)源性表達(dá)的Kv1.3通道調(diào)節(jié)作用

由于人源性白血病淋巴細(xì)胞系JurkatT細(xì)胞膜上主要表達(dá)電壓門控性鉀通道Kv1.3[10]，JurkatT細(xì)胞是研究生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)內(nèi)源性Kv1.3通道的優(yōu)良細(xì)胞模型.將JurkatT細(xì)胞膜電位鉗制在-60mV，予以400ms步長(zhǎng)、+50mV去極化電壓刺激，激發(fā)出細(xì)胞膜上Kv1.3通道電流，記錄不同濃度龍血竭總黃酮外液灌流時(shí)JurkatT細(xì)胞膜上Kv1.3通道電流的變化情況(見圖2).當(dāng)給予質(zhì)量濃度為0.01%的龍血竭總黃酮外液時(shí)，可將JurkatT細(xì)胞上的Kv1.3通道電流抑制55%以上，龍血竭總黃酮對(duì)Kv1.3通道的電流抑制呈現(xiàn)濃度依賴性特點(diǎn)，其抑制效應(yīng)可部分得以洗脫.通過Hill方程對(duì)龍血竭總黃酮抑制效應(yīng)的量效曲線進(jìn)行擬合，得到龍血竭總黃酮對(duì)內(nèi)源性Kv1.3通道的半數(shù)抑制濃度為(0.007199±0.000617)%.

A)龍血竭總黃酮對(duì)Jurkat T細(xì)胞Kv1.3通道的電壓-電流圖； B)龍血竭總黃酮抑制Jurkat T細(xì)胞Kv1.3通道電流的量效曲線(n=5)圖2 龍血竭總黃酮對(duì)Jurkat T細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的Kv1.3通道濃度依賴性抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of tFRD on endogenous Kv1.3 channels in Jurkat T cells with a concentration-dependent manner

2.3 龍血竭總黃酮對(duì)外源性表達(dá)的Kv1.3通道調(diào)節(jié)作用

HEK-293T細(xì)胞極少表達(dá)細(xì)胞外配體所需的內(nèi)生受體且易轉(zhuǎn)染，是一個(gè)常用的表達(dá)外源基因的細(xì)胞株.本研究將編碼mKv1.3通道的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-mKv1.3轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞24h，選用發(fā)綠色熒光的陽性細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，觀察不同濃度的龍血竭總黃酮對(duì)外源性表達(dá)的Kv1.3通道電流影響(見圖3).

A)龍血竭總黃酮對(duì)HEK-293T細(xì)胞Kv1.3通道的電壓-電流關(guān)系圖； B)龍血竭總黃酮抑制外源性Kv1.3通道電流的量效曲線(n=6)圖3 龍血竭總黃酮對(duì)外源性表達(dá)HEK-293T細(xì)胞上Kv1.3通道的濃度依賴性抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of tFRD on exogenous Kv1.3 channels in HEK-293T cells with a concentration dependent manner

龍血竭總黃酮對(duì)外源性表達(dá)Kv1.3通道抑制作用較強(qiáng)，呈濃度依賴性，當(dāng)細(xì)胞外液中龍血竭總黃酮濃度為0.01%時(shí)，HEK-293T細(xì)胞膜上Kv1.3通道電流被抑制了73%，抑制效應(yīng)可部分洗脫.通過Hill方程對(duì)龍血竭總黃酮抑制外源性Kv1.3通道電流的量效曲線進(jìn)行擬合，得到其半數(shù)抑制濃度為(0.001937±0.000228)%.

2.4 龍血竭總黃酮對(duì)其它電壓門控性鉀通道的影響

電壓門控性鉀通道具有不同的亞型，不同結(jié)構(gòu)的電壓門控性鉀通道在生物體具有不同功能.為探究龍血竭總黃酮阻斷Kv1.3的通道選擇性，本研究分別將編碼有通道m(xù)Kv1.1,hKv1.2的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-mKv1.1,pIRES2-EGFP-hKv1.2轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，24h后選用發(fā)綠色熒光的陽性細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗測(cè)試，記錄細(xì)胞外液中不同濃度龍血竭總黃酮對(duì)外源性表達(dá)的Kv1.1,Kv1.2通道電流的影響(見圖4). 較Kv1.3通道的作用，龍血竭總黃酮對(duì)Kv1.1和Kv1.2通道的抑制效果較微弱，0.01%高濃度的龍血竭總黃酮對(duì)Kv1.1和Kv1.2通道電流的抑制率分別只有50.8%和53.33%；通過Hill方程進(jìn)行量效曲線擬合，得到IC50分別為(0.011818±0.00132)%和(0.02698±0.00374)%.表明龍血竭總黃酮阻斷Kv1.3通道效率要高于Kv1.1和Kv1.2，活性差異分別為6.11倍和13.93倍，提示其對(duì)Kv1.3通道具有選擇性阻斷作用.

A,C)龍血竭總黃酮對(duì)HEK-293T細(xì)胞Kv1.1和Kv1.2通道的電壓-電流關(guān)系圖； B,D)龍血竭總黃酮抑制外源性Kv1.1和Kv1.2通道電流的量效曲線(n=6)圖4 龍血竭總黃酮對(duì)外源性表達(dá)的 Kv1.1和Kv1.2通道電流的影響Fig.4 Effects of tFRD on exogenous Kv1.1 and Kv1.2 channels

3 討論

Kv1.3通道是治療AID的理想新靶點(diǎn)[11]，開發(fā)Kv1.3通道阻斷劑的先導(dǎo)化合物是治療AID的重要途徑.為獲得新型Kv1.3通道阻斷劑，可從有毒動(dòng)物分泌的毒液中篩選特異性的生物活性多肽[12,13]，或從藥用植物中發(fā)現(xiàn)靶向阻斷通道的有機(jī)小分子[14]；前者雖具有較高的通道阻斷效率[15]，但多肽的不穩(wěn)定性和潛在抗原性限制了其成藥性，而源于藥用植物的有機(jī)小分子則受限較少，因此從天然植物中發(fā)現(xiàn)新型Kv1.3有機(jī)小分子阻斷劑正成為研究熱點(diǎn)[16].

龍血竭是傳統(tǒng)名貴中藥，具有活血化瘀、消炎止痛等廣泛的藥理作用，它還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，可濃度依賴性阻斷JurkatT淋巴細(xì)胞膜上Kv1.3通道[7]，是發(fā)現(xiàn)新型Kv1.3通道阻斷劑的天然藥物資源.但龍血竭組成復(fù)雜，包含黃酮類、萜類、酚類、甾體類等，為確定龍血竭阻斷Kv1.3通道的活性部位，縮小從龍血竭中篩選挖掘Kv1.3通道阻斷劑的范圍，本文在前期證實(shí)龍血竭總黃酮具有良好的離子通道蛋白阻斷作用的基礎(chǔ)上[8]，采用組優(yōu)化工藝[9]提取總黃酮，運(yùn)用電生理學(xué)技術(shù)檢測(cè)其對(duì)Kv1.3通道的調(diào)節(jié)作用.結(jié)果表明：龍血竭總黃酮對(duì)內(nèi)源性和外源性Kv1.3通道均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，呈現(xiàn)濃度依賴性，較Kv1.3通道的同源蛋白，具有一定的通道選擇性，說明龍血竭總黃酮部分介導(dǎo)了龍血竭對(duì)Kv1.3通道的阻斷作用，或能對(duì)自身免疫性疾病的防治研究提供思路.

龍血竭總黃酮中包括龍血素B、劍葉龍血素A、劍葉龍血素B等多種類型的查爾酮類化合物[18]，結(jié)構(gòu)類似但又有微小差別.研究發(fā)現(xiàn)龍血素B能高效率、高選擇性阻斷哺乳動(dòng)物Kv1.3通道[17]，引起通道的快速失活，表現(xiàn)出深部孔區(qū)阻斷特性，部分解釋了龍血竭總黃酮能夠選擇性阻斷Kv1.3通道的藥理學(xué)活性.但本文中龍血竭總黃酮并未體現(xiàn)這一深部孔區(qū)阻斷Kv1.3通道特性，提示龍血竭總黃酮中可能還存在其它調(diào)節(jié)Kv1.3通道的活性單體，其阻斷通道作用正是這些包括龍血素B在內(nèi)的多種活性單體共同作用的結(jié)果，深入研究它們調(diào)節(jié)Kv1.3通道的共性差異和構(gòu)效關(guān)系，將有助于闡明龍血竭總黃酮中查爾酮類等化合物調(diào)節(jié)Kv1.3通道的作用機(jī)理.