轉乙醇酸脫氫酶(GDH)基因棉花的獲得及表型鑒定

張樹偉，張義茹，馬燕斌，李換麗，Rupert Fray，韓淵懷*

(1.山西省農業(yè)科學院 棉花研究所，山西 運城 044000；2.山西省農業(yè)科學院 作物科學研究所，山西 太原 030031；3.山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801)

光合作用與光呼吸是植物體內重要的碳同化和碳代謝途徑，二者密切聯(lián)系又互相影響。光合作用碳同化階段的第一個關鍵酶，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)具有雙重催化特性，既能催化1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)與CO2進行羧化反應起始光合反應碳反應過程，又能催化RuBP與O2進行加氧反應起始光呼吸反應[1～3]。該酶的催化活性依賴于CO2與O2濃度的比值，比值高則促進羧化反應，比值低則促進加氧反應[4, 5]。研究發(fā)現(xiàn)植物進行光呼吸伴隨著能量的消耗，降低了光合效率，尤其是C3植物，因光呼吸作用較強，可使凈光合速率降低25%～30%[6～8]。因此，減少C3植物的光呼吸消耗，可以間接提高光合效率，從而有助于提高作物產(chǎn)量[9]。

乙醇酸脫氫酶(GDH)是一個多聚體，由GlcD、GlcE、GlcF 3個亞基構成。細菌等一些非光合微生物體內存在一個乙醇酸代謝途徑，在GDH參與下將乙醇酸轉變?yōu)橐胰┧?，乙醛酸在乙醛酸醛連接酶(GCL)和羥基丙二酸半醛還原酶(TSR)參與下轉變?yōu)楦视退?，使之在不利環(huán)境中正常生長[10, 11]。Kebeish等[12]利用該細菌代謝途徑，分別構建了編碼GlcD、GlcE、GlcF、GCL和TSR的載體導入擬南芥，在擬南芥中建立一條光呼吸代謝支路。該途徑完全利用原先光呼吸代謝途徑的中間產(chǎn)物，并將原先在線粒體中釋放的CO2變成在葉綠體中釋放，從而使細胞中CO2/O2比值增加，促進Rubisco的羧化反應提高了光合作用；獲得的轉基因擬南芥生長更快，株型更大，總生物量比野生型明顯增加。N?lke等[13]構建了含有GDH的載體，用35S 啟動子驅動，轉入馬鈴薯中建立光呼吸支路，發(fā)現(xiàn)轉基因馬鈴薯不僅株型比對照明顯增大，植株總生物量和可溶性糖積累也比對照顯著增加。Dalal等[14]將GDH構建于一個載體(DEF2)，將GCL和TSR構建于一個載體(GT1)，分別導入亞麻薺中建立光呼吸支路，發(fā)現(xiàn)轉基因株系均實現(xiàn)了減弱光呼吸和增強光合效率；其中獨立轉基因株系(DEF2)的種子產(chǎn)量比野生型增加50%～57%，全支路轉基因株系(DEF2+GT1)的種子產(chǎn)量比野生型增加57%～73%；同時，轉基因株系的植被生物量增加，開花結籽到種子成熟的發(fā)育期更快。

本試驗擬利用上述構建光呼吸支路的思路，克隆大腸桿菌乙醇酸脫氫酶基因GDH，連接含35S強啟動子的表達載體上。以陸地棉常規(guī)品種為試驗材料R15，利用農桿菌介導法將融合載體導入棉花中[15]。利用分子生物學方法篩選陽性轉基因植株，并通過表型鑒定及生理檢測，探索棉花中建立光呼吸支路來提高光合效率進而提高產(chǎn)量的可行性，為培育新型高產(chǎn)棉花提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料為陸地棉(Gossypiumhirsutum)常規(guī)品種R15，農桿菌菌株為LBA4404，由山西省農業(yè)科學院棉花研究所生物技術室提供。乙醇酸脫氫酶基因GDH由英國諾丁漢大學植物科學院提供，載體pBSK(+)抗性Amp，構建的融合基因由35S啟動表達。

EasyPure Plant Genomic DNA Ki，EasyPure HiPure Plasmid MaxiPrep Kit購于北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司，常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 棉花遺傳轉化及再生植株獲得

陸地棉R15經(jīng)濃硫酸脫絨后，于75%乙醇中消毒30 s，雙氧水中消毒3～4 h，滅菌水清洗5～6次后，在超凈臺上播種于萌發(fā)培養(yǎng)基。在22 ℃暗處培養(yǎng)1周后，將長出的下胚軸切成0.5～1 cm大小，用于農桿菌浸染。

含外源乙醇酸脫氫酶基因的農桿菌菌株接種于含Rif和Amp的LB液體培養(yǎng)基中[16]，28 ℃于恒溫搖床200 r·min-1培養(yǎng)過夜。5000 r·min-1離心5 min收集農桿菌體，倒掉上清液，用30 g·L-1葡萄糖溶液懸浮，重復離心收集菌體一次，再用適當體積該溶液懸浮，調節(jié)OD600值為0.6～0.8，浸染上述已切成小段的下胚軸材料7～8 min，于22 ℃暗處共培養(yǎng)48 h后，轉入含Amp的篩選培養(yǎng)基，于光/暗周期16 h/8 h，恒溫22 ℃人工氣候室培養(yǎng)。每隔20 d換一次新鮮培養(yǎng)基，長出胚性愈傷組織后轉入分化培養(yǎng)基，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔20 d換一次新鮮培養(yǎng)基。長出再生幼苗嫁接于溫室，取幼嫩葉片提取DNA進行PCR篩選陽性株系，于盛花期人工自交并收獲自交種子。

1.3 棉花基因組DNA提取及PCR檢測

獲得棉花轉基因材料種植于山西省農科院棉花研究所轉基因試驗田，田間常規(guī)管理，出苗4周后取主莖嫩葉置于冷凍管中液氮速凍，并于-80 ℃保存。

利用優(yōu)化過的CTAB法[17]提取基因組DNA，用對應引物進行PCR擴增。具體反應體系(表1)如下：

取5 μL PCR產(chǎn)物于0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照，剩余PCR產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR反應體系Table 1 PCR reaction system

1.4 光合特性測定

在晴朗無風的早晨10:00～11:30，選擇棉花打頂前主莖倒4葉，采用LI-6400便攜式光合儀(LI-COR，Lincoln，USA)測定葉片的氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)等，采用開放式氣路測定，氣溫為33～36 ℃。每株系重復3次測定取平均值。

1.5 表型觀察及干物質分析

通過PCR檢測陽性的轉基因棉花不同株系按株行播種于轉基因試驗田，對照(CK)材料選用受體棉花材料R15，田間常規(guī)管理。植株打頂前測量地上部分株高，果枝數(shù)及子葉節(jié)以上總葉片數(shù)。取轉基因株系和對照材料倒4葉，分別編號拍照。按編號測定各葉片鮮重，裝入牛皮紙信封于烘箱中105 ℃殺青30 min，80 ℃繼續(xù)烘干至恒重，測定葉片干重，每株系重復3次測定取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 農桿菌介導的棉花轉基因及再生苗獲得

用含外源基因的農桿菌浸染陸地棉下胚軸外植體，在黑暗共培48 h后，轉入含100 mg·L-1Amp的篩選培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導。在該篩選條件下，成功轉化的外植體細胞會逐漸形成愈傷細胞，沒有轉化成功的外植體會褐化死亡(圖1A)；經(jīng)過一段時間誘導培養(yǎng)，愈傷細胞會快速增殖形成淡黃色愈傷組織(圖1B)；愈傷組織經(jīng)過3～4次繼代培養(yǎng)出現(xiàn)胚性愈傷，胚性愈傷組織在分化培養(yǎng)基中持續(xù)繼代3～4次分化出幼芽(圖1C)；幼芽繼續(xù)培養(yǎng)一段時間出現(xiàn)根和葉片形成幼苗(圖1D)；幼苗在培養(yǎng)基中生長一段時間后嫁接到砧木上在溫室繼續(xù)培養(yǎng)成活。

圖1 農桿菌介導的轉基因棉花再生株的獲得Fig.1 Regeneration of cotton tissue cultures by Agrobacterium-mediated transformation注：A：農桿菌浸染棉花下胚軸誘導愈傷；B：愈傷組織增殖；C：胚性愈傷分化幼苗；D：轉基因再生苗植株Note：A: Induction of cotton hypocotyl callus after Agrobacterium infection; B: Callus proliferation; C: Embryogenic callus differentiation seedlings; D: The regeneration of transgenic seedlings

2.2 再生植株外源基因的PCR檢測

對轉化出幼苗并嫁接成活的再生株系提取基因組DNA，用特異性引物進行片段檢測，PCR擴增得到大小約710 bp的特異性條帶，該條帶與以質粒為模板擴增的片段大小吻合(圖2)。

圖2 部分轉基因棉花PCR檢測結果Fig.2 PCR analysis of partial transgenic cotton plantsM：DL2000 DNA Marker; P：質粒Plasmid; +：陽性 Positive；-：陰性 Negative

2.3 植株光合參數(shù)分析

與對照相比，轉基因株系編號9、17、21、22凈光合速率均有不同程度增加，分別提高37.29%、34.09%、35.87%和26.99%；氣孔導度在各轉基因株系間差異不明顯，但比對照明顯降低；胞間CO2濃度均比對照降低，分別降低26.56%、14.63%、27.73%和24.56%；蒸騰速率較對照沒有顯著差異(表2)。

表2 田間光合特性測定Table 2 Determination of photosynthetic parameters of different plants

注:同列不同小寫字母表示差異極顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column. The same below.

2.4 植株表型及干物質積累變化

通過轉入外源基因在植物體內建立光呼吸支路有望減少能量消耗，預期株型高大，生物量增加[12]。試驗結果表明，與對照相比，轉基因株系明顯株高增加，葉片變大(圖3)。編號9和21的株高與對照有顯著差異，分別增加16.18% 和13.53%，編號17和22與對照顯著性較弱，分別增加12.47% 和10.07%(表3)。植株果枝數(shù)和總葉片數(shù)與對照比較，均無顯著差異。葉片鮮重和干重比CK有不同程度增加，鮮重較CK分別增加21.59%、43.89%、44.25%和29.71%；干重比CK分別增加11.86%、17.79%、17.47% 和11.06%(表4)。

圖3 田間表型鑒定Fig.3 Phenotypic identification in the field

3 討論與結論

C3植物和C4植物由于葉片組織結構不同，其光合作用存在不同的碳固定機制。C4植物中Rubisco羧化性高于氧化性使其光呼吸程度大幅減弱，光合效率顯著提高[6, 18]。 抑制植物光呼吸來提高光合效率一直是作物高產(chǎn)研究的重點，但單純抑制光呼吸并未有效提高光合效率，完全抑制光呼吸甚至會使植物致死[19～22]。研究者們將細菌體內的乙醇酸代謝途徑引入擬南芥[12]中建立光呼吸支路，抑制其光呼吸速率，提高了光合效率，且獲得的轉基因擬南芥株型明顯變大，葉面積增加，鮮重和干物質均顯著增加。將該代謝途徑導入馬鈴薯[13]中建立光呼吸支路，乙醇酸脫氫酶活性高的轉基因株系不僅株型變大，可溶性糖等能量物質積累顯著增多，馬鈴薯塊莖的產(chǎn)量也明顯增加。利用相似思路在亞麻薺[14]中建立光呼吸支路，轉基因株系也實現(xiàn)了光呼吸減弱和光合效率增強，且轉基因亞麻薺葉面積變大，油料種子的產(chǎn)量明顯增加，氨基酸等多種營養(yǎng)物質含量也明顯增多?？梢姲鸭毦掖妓岽x途徑導入C3植物中構建光呼吸支路，可使其光呼吸能量消耗減少，間接提高光合效率，對植物株型、葉面積等產(chǎn)生較大的影響，使植物生物量明顯增加。

表3 田間性狀調查統(tǒng)計Table 3 Statistical analysis of traits in the field

表4 葉片鮮重與干重測定/gTable 4 Determination of fresh and dry weight of leaves

棉花作為C3植物，光合效率受光呼吸影響較嚴重，通過上述途徑改變其光呼吸途徑來減弱光呼吸是提高其光合作用率及產(chǎn)量的一種有效辦法。本研究將GDH導入棉花受體中，用35S啟動子驅動，在棉花植株中構建光呼吸支路。試驗結果表明轉基因植株凈光合效率均比對照提高，而氣孔導度和胞間CO2濃度比對照降低，推測光呼吸支路在胞內產(chǎn)生CO2使Rubisco羧化活性增強，胞間CO2被利用導致其濃度降低，而氣孔導度降低進一步阻止了胞間CO2濃度的增加。田間轉基因植株表現(xiàn)出株高增加，葉片增大特征，同時葉片干物質積累也有顯著差異。而果枝數(shù)和總葉片數(shù)較對照組沒有顯著差異，這暗示該基因抑制光呼吸減少消耗的能量更多積累到莖干和葉片上使植株高大，而非生長出新葉、新果枝。但田間觀察部分轉基因株系盛鈴期仍有較多花蕾出現(xiàn)，由此推測該基因的導入可能對棉花生殖生長期有影響，需從全生育期角度進一步研究。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同轉基因材料出現(xiàn)高低分離情況，但由于獲得轉基因植株數(shù)量有限，因此不能直觀判斷是否符合孟德爾遺傳分離比，也需要進一步加代獲得純合株系進行深入研究。

本研究將乙醇酸脫氫酶GDH基因導入陸地棉受體，成功獲得了轉基因再生植株，并通過分子檢測篩選出36株陽性轉化植株。經(jīng)田間表型鑒定，發(fā)現(xiàn)轉基因植株較對照凈光合效率提高，株高增加、葉片增大、葉片干物質積累增多。本研究初步探索了一條通過抑制棉花光呼吸來提高光合效率及植株生物量的方法，為今后培育新型高光效棉花及擴充高產(chǎn)棉花種質資源庫奠定了基礎。