伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病一家系中NOTCH3基因的新突變

楊程程，滕軍放，丁雪冰，王雪晶

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

伴皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy， CADASIL)是一種單基因遺傳性腦小血管病，是由位于人類19號(hào)染色體短臂上的NOTCH3基因突變所致[1-3]。CADASIL一般中年起病，與傳統(tǒng)的腦血管病不同，其通常無(wú)明確的腦血管病高危因素，以反復(fù)腦卒中發(fā)作為主要表現(xiàn)，同時(shí)可伴隨認(rèn)知障礙、癡呆、精神情緒紊亂及有先兆的偏頭痛等。繼2000年第1例CADASIL家系在中國(guó)被報(bào)道之后，共有20多種NOTCH3基因突變逐漸被發(fā)現(xiàn)[4]，全世界成千上萬(wàn)CADASIL家系在不同種族中被發(fā)現(xiàn)，然而由于不同種族及地域CADASIL的臨床表現(xiàn)、基因突變類型等差異較大，這類疾病仍經(jīng)常被忽視和誤診[5]。MRI上可以發(fā)現(xiàn)較多皮質(zhì)下缺血灶及廣泛的白質(zhì)病變，是診斷CADASIL腦部血管損害的重要手段。目前，CADASIL的診斷除臨床癥狀和影像學(xué)檢查之外，最重要的是基因檢測(cè)及病理學(xué)組織活檢。組織活檢能夠檢驗(yàn)出血管壁內(nèi)NOTCH3基因編碼蛋白的存在及平滑肌細(xì)胞膜和膜外基質(zhì)之間顆粒狀嗜鋨物質(zhì)的存在[6]。由于皮膚組織較中樞神經(jīng)組織容易取材，且皮膚通常也可以發(fā)現(xiàn)顆粒狀嗜鋨物質(zhì)的存在，因此皮膚活檢是此病病理學(xué)診斷中經(jīng)常采用的檢測(cè)方法[7-9]。由于我國(guó)基因診斷技術(shù)應(yīng)用的局限性，經(jīng)病理及基因檢測(cè)確診的CADASIL家系在國(guó)內(nèi)較少，且目前關(guān)于NOTCH3基因突變熱點(diǎn)的報(bào)道多位于第3、4、11、12、13、14、18號(hào)等外顯子[10]。本文確診了1例NOTCH3基因第6號(hào)外顯子基因突變所致的CADASIL家系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料2018年5月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的1例疑似CADASIL患者，家系圖譜見(jiàn)圖1?；颊吣校?9歲，慢性起病，以“反應(yīng)遲鈍1 a余”為主訴入院；1 a余前逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、記憶力下降、表情減少、主動(dòng)與人溝通能力下降。5個(gè)月前上述癥狀加重，且出現(xiàn)理解力下降、右側(cè)肢體無(wú)力、步態(tài)不穩(wěn)、言語(yǔ)不利，至北京某醫(yī)院行腦脊液免疫學(xué)相關(guān)檢查未見(jiàn)異常，栓子檢測(cè)、發(fā)泡試驗(yàn)均未見(jiàn)異常。

查體：意識(shí)清楚，精神一般，語(yǔ)言欠流利，記憶力減退，理解力差，計(jì)算力差，判斷力正常，右利手。雙側(cè)額紋對(duì)稱，雙側(cè)眼裂對(duì)稱，閉目有力，右側(cè)鼻唇溝變淺，示齒口角左偏，鼓腮不漏氣。伸舌充分，舌尖位置右偏，無(wú)舌肌萎縮及肌束震顫。無(wú)肌肉萎縮及假性肌肥大。四肢肌張力正常，左側(cè)肢體肌力5級(jí)，右側(cè)肢體肌力5(-)級(jí)。右上肢腱反射稍活躍，左上肢腱反射正常。雙下肢腱反射減弱。雙側(cè)指鼻試驗(yàn)穩(wěn)準(zhǔn)，右側(cè)跟膝脛試驗(yàn)欠穩(wěn)準(zhǔn)，Romberg征陰性。無(wú)不自主運(yùn)動(dòng)，步態(tài)正常。右側(cè)巴氏征陰性，左側(cè)巴氏征可疑陽(yáng)性。雙側(cè)唇反射陽(yáng)性，雙側(cè)掌頦反射陽(yáng)性。

影像學(xué)檢查：頭顱MRI示左側(cè)側(cè)腦室后角急性梗死灶。雙側(cè)額頂葉、雙側(cè)半卵圓中心、放射冠、雙側(cè)丘腦及基底節(jié)區(qū)、橋腦缺血灶及腔梗。頭顱MRA示顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化，右側(cè)椎動(dòng)脈顱內(nèi)段纖細(xì)。頭頸聯(lián)合CTA示主動(dòng)脈弓局部管壁增厚并點(diǎn)狀鈣斑影，管腔未見(jiàn)明顯狹窄；右側(cè)椎動(dòng)脈較對(duì)側(cè)纖細(xì)，硬膜內(nèi)段為著。結(jié)果見(jiàn)圖2。

既往史：吸煙史10余年，無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂病史。

該家系中先證者父親生前有該病臨床癥狀，先證者及其兄有明確的臨床癥狀，其他現(xiàn)存親屬尚無(wú)臨床癥狀。先證者兄(Ⅲ5),52歲，以“反應(yīng)遲鈍5 a”為主要臨床癥狀，此外疑似伴隨認(rèn)知功能障礙，拒絕就診。

■男性患者；□正常男性；○正常女性；/已死亡；先證者

圖1先證者家系圖譜

1.2皮膚活檢告知先證者并獲得其知情同意后，取其脛骨前部一塊約1 cm×1 cm大小的皮膚組織進(jìn)行活檢。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行固定、乙醇脫水、浸蠟包埋、切片、貼片、HE染色，光鏡與電鏡下觀察。

A：MRI T2加權(quán)像示雙側(cè)頂葉、雙側(cè)側(cè)腦室旁多發(fā)斑片狀高信號(hào)；B： T2 FLair像上雙側(cè)頂葉、雙側(cè)側(cè)腦室后角多發(fā)軟化灶；C：SWI像上雙側(cè)丘腦、右側(cè)基底節(jié)區(qū)、右側(cè)顳頂葉、左側(cè)額葉少量含鐵血黃素沉積或微出血灶；D：腦MRA未見(jiàn)明顯局限性狹窄或閉塞；E：CTA示主動(dòng)脈弓局部管壁增厚并點(diǎn)狀鈣斑影，管腔未見(jiàn)明顯狹窄，右側(cè)椎動(dòng)脈較對(duì)側(cè)纖細(xì)，硬膜內(nèi)段為著

圖2先證者頭顱影像學(xué)表現(xiàn)

1.3高通量捕獲測(cè)序

1.3.1 全基因組DNA的提取與樣本處理 在知情同意的情況下，采用EDTA抗凝采血管采集先證者、先證者兄、先證者子女外周靜脈血5 mL，-20 ℃保存。然后采用血液提取試劑盒提取血液DNA，取1.5 μg DNA樣本進(jìn)行超聲打斷，得到150～200 bp的DNA片段。

1.3.2 DNA文庫(kù)構(gòu)建及樣本捕獲 采用KaPa末端修復(fù)酶修復(fù)DNA，用AMPure磁珠進(jìn)行純化，并采用KaPa Atailing試劑在DNA 3’端添加A堿基，然后采用KaPa DNA Ligase將Adapter連接到DNA片段上，最后進(jìn)行文庫(kù)模板量平衡的線性擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL。反應(yīng)條件：2×KaPa HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL，PCR Primer Premix 1 μL，Adapter-ligated library DNA 10 μL，加水至總體積25 μL。反應(yīng)程序如下：98 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，8個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min。

真空濃縮DNA文庫(kù)樣本進(jìn)行雜交捕獲。反應(yīng)條件為：DNA文庫(kù)樣本10 μL 95 ℃加熱5 min后，加熱SureSelect雜交緩沖液且置65 ℃，5 min后捕獲探針文庫(kù)混合液，65 ℃孵育2 min。取14 μL的雜交緩沖液加入探針文庫(kù)混合液中，再將全部樣本文庫(kù)溶液加入，65 ℃孵育 24 h。取50 μL鏈霉親和素(SA)包被的Dynal磁珠(Invitrogen公司產(chǎn)品)，用300 μL結(jié)合緩沖液洗滌3次后200 μL結(jié)合緩沖液重懸Dynal磁珠，并將完成捕獲反應(yīng)的樣品全部加入，放入翻轉(zhuǎn)混勻儀中室溫混勻孵育30 min。置磁力架靜置，待磁珠完全吸附至側(cè)壁后去上清。200 μL洗滌緩沖液1重懸，放入翻轉(zhuǎn)混勻儀中室溫混勻孵育15 min。去上清后加200 μL 65 ℃預(yù)熱的洗滌緩沖液2重懸，置恒溫混勻儀中孵育10 min，重復(fù)3次。用40 μL的洗脫緩沖液重懸磁珠。取20 μL重懸磁珠，使用Agilent公司的試劑盒提供的試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s；65 ℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸30 s，14個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸4 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用Ampure磁珠進(jìn)行純化，并進(jìn)行Qubit定量。

1.3.3 測(cè)序 取捕獲后的DNA樣本進(jìn)行Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序。參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院相關(guān)指南進(jìn)行數(shù)據(jù)解讀和生物信息學(xué)分析，并與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMDpro)進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1皮膚組織活檢結(jié)果光鏡下，皮膚組織、表皮基底層色素增多，真皮淺層小血管周圍少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3A)，淺、深層部分小血管壁增厚(圖3B)。電鏡下，小動(dòng)脈管壁可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞(圖3C)，平滑肌細(xì)胞肌膜下密斑豐富(圖3D)，平滑肌細(xì)胞膜和膜外基質(zhì)間可見(jiàn)多個(gè)嗜鋨顆粒沉積，電子密度不一(圖3E)。

A、B：光鏡(HE，×200)；C、D、E:電鏡

2.2基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。NOTCH3基因第6號(hào)外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)一處雜合突變點(diǎn)：c.811T>C，導(dǎo)致氨基酸改變(半胱氨酸>精氨酸)。HGMDpro數(shù)據(jù)庫(kù)未見(jiàn)報(bào)道。

圖4 NOTCH3基因 第6號(hào)外顯子區(qū)的雜合突變(c.811T>C)

3 討論

CADASIL是一種常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病。其臨床特征及影像學(xué)表現(xiàn)被逐步認(rèn)識(shí) 。典型的臨床特征包括30歲左右出現(xiàn)的先兆性偏頭痛，伴有皮質(zhì)下梗死并在40歲左右出現(xiàn)相關(guān)癥狀，50歲左右開(kāi)始出現(xiàn)認(rèn)知功能下降。CADASIL的頭部MRI表現(xiàn)與年齡和疾病階段相關(guān)，表現(xiàn)為T2加權(quán)像和T2 Flair像上的對(duì)稱的、廣泛的大面積高信號(hào)，DWI像上可出現(xiàn)彌散受限的高信號(hào)病灶，即急性或亞急性腦梗死灶；白質(zhì)病變經(jīng)常累及前顳葉、外囊、額上回和顳極，這些特殊部位的病變對(duì)診斷具有高度的敏感性和特異性，但在亞洲人群中，顳葉病變較為少見(jiàn)[10]。本文家系中2例患者的發(fā)病年齡、先證者的影像學(xué)表現(xiàn)與之前報(bào)道的基本一致。

CADASIL的病理生理機(jī)制主要是由于變異的NOTCH3蛋白聚集體(顆粒狀嗜鋨物質(zhì))沉積在中等大小的動(dòng)脈血管壁的平滑肌細(xì)胞表面，造成血管狹窄閉塞，進(jìn)而導(dǎo)致腦缺血發(fā)作。這種沉積通常為全身性、系統(tǒng)性的，但以腦血管壁上的沉積更顯著，在腦血管以外的區(qū)域，如皮膚和肌肉血管，也可以發(fā)現(xiàn)顆粒狀嗜鋨物質(zhì)的存在[1-3]。NOTCH3基因突變是CADASIL發(fā)病的主要遺傳機(jī)制。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)數(shù)千個(gè)CADASIL家系，其中200多種不同的NOTCH3基因變異已被證實(shí)，而在中國(guó)大陸的CADASIL家系中，NOTCH3基因突變熱點(diǎn)主要位于3、4、11、12、13、14號(hào)外顯子[11-12]。目前大部分的研究[13]認(rèn)為在CADASIL家系中，NOTCH3基因突變導(dǎo)致表皮樣生長(zhǎng)因子重復(fù)區(qū)域內(nèi)半胱氨酸殘基的重復(fù)或丟失，從而導(dǎo)致其編碼的跨膜蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的變化。在本文報(bào)道的CADASIL家系中，NOTCH3基因第6號(hào)外顯子的突變(c.811T>C)使半胱氨酸變?yōu)榫彼幔茐牧硕蜴I的原有結(jié)構(gòu)，使其編碼的跨膜蛋白失去相應(yīng)功能，變異的NOTCH3蛋白聚集體(顆粒狀嗜鋨物質(zhì))沉積在中等大小的動(dòng)脈血管壁的平滑肌細(xì)胞表面，造成血管狹窄閉塞，進(jìn)而導(dǎo)致腦缺血發(fā)作。另外皮膚組織活檢也進(jìn)一步證實(shí)了這種顆粒狀噬鋨物質(zhì)不僅在腦血管內(nèi)沉積，在皮膚血管內(nèi)也有沉積。與之前的發(fā)現(xiàn)的突變類型不同，本文主要報(bào)道了1個(gè)中國(guó)CADASIL家系中新的NOTCH3基因雜合突變類型(c.811T>C)，該突變位點(diǎn)位于第6號(hào)外顯子，HGMDpro數(shù)據(jù)庫(kù)尚未見(jiàn)報(bào)道。

綜上所述，作者的研究為CADASIL的分子遺傳機(jī)制提供了新的證據(jù)，若進(jìn)一步在大樣本中得到證實(shí)，則可能預(yù)測(cè)這一類基因突變導(dǎo)致的臨床表型，提高CADASIL的臨床診治率。