抑制組織蛋白酶B表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

孫堅(jiān)皓，孫建廣，黃世磊，馬招鑫，皮國富

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州450052

組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)是一種與木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)相似的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，其在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮重要作用[1-3]，并在多種腫瘤細(xì)胞(如胃癌[4]、肺癌[5]、結(jié)直腸癌[6]、食管癌[7]及前列腺癌[8])中呈現(xiàn)高表達(dá)，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程；有研究[9]表明CB在骨肉瘤細(xì)胞中也呈現(xiàn)高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用小干擾RNA(siRNA)特異性下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞MG63中CB的表達(dá)，觀察其對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料人骨肉瘤MG63細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，鼠抗人CB單克隆抗體和兔抗人α-tubulin單克隆抗體購自美國Abcam公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，8.0 μm孔徑Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。陰性對(duì)照siRNA(NC-siRNA)、靶向CB基因的siRNA序列1～3(CB-siRNA1～3)由廣州銳博有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2細(xì)胞分組、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將人骨肉瘤MG63細(xì)胞分成空白對(duì)照組、siRNA-1組(轉(zhuǎn)染CB-siRNA-1)、siRNA-2組(轉(zhuǎn)染CB-siRNA-2)、siRNA-3組(轉(zhuǎn)染CB-siRNA-3)和NC組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA)5組。取處于對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，均在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對(duì)飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)按siRNA轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.3各組細(xì)胞中CB蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法(按試劑盒說明書步驟進(jìn)行)測(cè)定蛋白濃度后煮沸變性，按照試劑盒說明制備SDS-PAGE凝膠并進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉液室溫封閉1 h，加入鼠抗人CB單克隆抗體(按1∶1 200稀釋)、兔抗人α-tubulin單克隆抗體(按1∶2 000稀釋)4 ℃環(huán)境下過夜孵育，TBST洗3遍，5 min/次。加入HRP標(biāo)記的二抗(分別按1∶2 000、1∶5 000稀釋)孵育1 h。TBST洗3遍，5 min/次。于暗室內(nèi)用化學(xué)發(fā)光ECL顯影液顯示蛋白條帶。應(yīng)用Image J軟件計(jì)算各蛋白灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4各組細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)采用CCK-8法，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分為空白對(duì)照組和siRNA-2組接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，6×103個(gè)/孔。分組轉(zhuǎn)染后，分別在0、24、48、72和96 h后換液，并加入CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長吸光度值。

1.5各組細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分為空白對(duì)照組、siRNA-2組、NC組3組，給予相應(yīng)處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。10 d后用40 g/L的多聚甲醛固定20 min，1.25 g/L結(jié)晶紫甲醇溶液染色2 min，PBS清洗殘留染色液后拍照，并計(jì)算細(xì)胞數(shù)>50個(gè)的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6各組細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)在6孔板板底用記號(hào)筆水平劃5條互相平行的定位線。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分為空白對(duì)照組、siRNA-2組、NC組3組接種于該6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，給予相應(yīng)處理。培養(yǎng)至細(xì)胞密度為90%～100%時(shí)，用200 μL移液槍槍頭于每孔中線垂直于定位線做劃痕，然后每孔加2 mL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。于劃痕后0、6和12 h在倒置顯微鏡下定點(diǎn)拍照，然后用Image J軟件分別計(jì)算0、6、12 h后的劃痕面積。用[0 h劃痕面積分別-6(或12 h)劃痕面積]/0 h劃痕面積×100%計(jì)算劃痕愈合率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7各組體外侵襲實(shí)驗(yàn)將Matrigel膠用DMEM培養(yǎng)基按1∶8稀釋，每個(gè)小室加入稀釋液50 μL，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫放置30 min。取空白對(duì)照組、siRNA-2組、NC組轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞，常規(guī)胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/L，每孔取100 μL細(xì)胞懸液接種于上室，下室每孔加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取出小室，用40 g/L多聚甲醛固定20 min，1.25 g/L結(jié)晶紫甲醇溶液染色2 min，棉簽拭去上室面細(xì)胞，PBS清洗殘留染色液，100倍倒置顯微鏡下每孔選取上、下、左、右、中5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組MG63細(xì)胞中CB蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞克隆形成能力、細(xì)胞劃痕愈合率和細(xì)胞侵襲能力的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組MG63細(xì)胞中CB蛋白的表達(dá)比較見圖1。由圖1可知，siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組CB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.498±0.012)、(0.198±0.025)和(0.625±0.006)，空白對(duì)照組及NC組分別為(2.004±0.013)和(1.596±0.057)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=441.768，P<0.001)，其中siRNA-2組CB蛋白相對(duì)表達(dá)量最低，故將siRNA-2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2各組MG63細(xì)胞增殖能力的比較見表1。

2.3各組MG63細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果siRNA-2組細(xì)胞克隆形成數(shù)(74.3±4.5)明顯低于空白對(duì)照組及NC組[(103.0±10.1)和(109.7±14.6)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.450，P<0.001)。

1：NC組；2：siRNA-3組；3：siRNA-2組；4：siRNA-1組；5：空白對(duì)照組

圖1 各組MG63細(xì)胞中CB蛋白的表達(dá)

2.4各組MG63細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 各組MG63細(xì)胞劃痕愈合率 %

*：與其他兩組比較，P<0.05

2.5各組MG63細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。siRNA-2組細(xì)胞侵襲數(shù)(48.6±9.5)與空白對(duì)照組(93.6±12.1)及NC組(102.4±21.1)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.677，P<0.001)。

A：空白對(duì)照組；B：siRNA-2組；C：NC組

3 討論

目前對(duì)骨肉瘤發(fā)病、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的分子機(jī)制研究尚未完善，蛋白質(zhì)的異常表達(dá)是惡性轉(zhuǎn)化的重要特征。組織蛋白酶家族在多種腫瘤組織中特異性高表達(dá)；組織蛋白酶D(CD)被認(rèn)為是潛在的目標(biāo)蛋白，CD在骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移和化療耐藥中的表達(dá)增加表明CD在OS的病理過程中具有重要作用[10]，同時(shí)CD可以激活CB[11]；降低骨肉瘤細(xì)胞組織蛋白酶K(CK)的表達(dá)后可顯著降低其增殖、侵襲能力[12]。以上可以看出組織蛋白酶家族在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

RNA干擾(RNAi)是雙鏈核糖核酸(dsRNA)特異性調(diào)節(jié)基因活性的天然過程，它以特異性沉默靶基因表達(dá)為特征，在疾病治療中具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值[13-14]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用脂質(zhì)體將合成的CB-siRNA轉(zhuǎn)染入MG63細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和NC組相比，CB-siRNA轉(zhuǎn)染組CB表達(dá)量下降，說明CB-siRNA能特異且有效地抑制CB的表達(dá)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制CB表達(dá)后MG63細(xì)胞增殖能力明顯減弱，證明CB可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。有研究[15]表明，抑制CB后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力也減弱，與本文結(jié)果相一致。腫瘤細(xì)胞的遷移能力是轉(zhuǎn)移至繼發(fā)部位所必需的，本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制CB表達(dá)后，MG63細(xì)胞的遷移能力明顯減弱，說明CB對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的遷移起積極作用。有研究[16]報(bào)道，在前列腺癌中降低CB表達(dá)后細(xì)胞遷移能力也降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。腫瘤的侵襲是其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，研究[17]表明，腫瘤的侵襲發(fā)生在低pH區(qū)域，酸性胞外環(huán)境能夠誘導(dǎo)溶酶體迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外周，導(dǎo)致溶酶體胞吐增加，分泌大量的CB，CB作用于基膜，促使基膜蛋白Ⅳ型膠原的降解增加，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究中Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)CB表達(dá)后MG63細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯減少，說明沉默CB后MG63細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，也證明了CB參與骨肉瘤的侵襲過程。有研究表明，下調(diào)一些腫瘤細(xì)胞(子宮內(nèi)膜癌[15]、前列腺癌[16]、乳腺癌[18])CB表達(dá)后，其細(xì)胞侵襲能力亦明顯降低，與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果證明，CB可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的惡性行為，參與骨肉瘤的增殖、遷移及侵襲過程，因此CB有望成為骨肉瘤基因治療的有效靶點(diǎn)。

綜上所述，CB參與了骨肉瘤的惡性進(jìn)展，有可能成為治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。但是，該研究也存在不足之處，如僅從細(xì)胞學(xué)方面證明了CB在骨肉瘤中的作用，因此，下一階段作者將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)結(jié)論。