胃癌組織中細絲蛋白A表達變化及其對患者預(yù)后的影響

崔國才，史建偉，彭鑫宇，郭劍，劉小銳，李杰

(1 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000；2 河北大學(xué)附屬醫(yī)院)

胃癌是消化道的常見惡性腫瘤之一，我國每年新增胃癌患者約50萬，占全球的50%左右，并且發(fā)病率和病死率呈上升趨勢[1]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因。細絲蛋白A(FLNa)是非肌性肌動蛋白結(jié)合蛋白家族成員之一，其通過調(diào)控細胞骨架結(jié)構(gòu)的動態(tài)改變而調(diào)節(jié)機體細胞的分裂、增殖、遷移和侵襲等諸多生物行為，同時還是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的支架蛋白，與腫瘤的形成發(fā)展密切相關(guān)[2～5]。但FLNa與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未見系統(tǒng)報道。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測FLNa蛋白在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達情況，并分析其表達與患者臨床特征、生存期及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取河北大學(xué)附屬醫(yī)院2006年1月～2007年1月收治的51例胃癌患者,其中男29例、女22例，≥60歲25例、<60歲26例。所有入組病例經(jīng)病理學(xué)確診，無其他器官原發(fā)惡性腫瘤，術(shù)前無放療、化療、免疫治療及中醫(yī)藥治療史，都有完整的臨床和隨訪資料。手術(shù)切除腫瘤組織，癌組織取自癌灶中心處，正常胃黏膜組織取自距癌灶邊緣至少5 cm處。隨訪截止日期為2012年7月。

1.2 FLNa檢測 免疫組化采用SP法。胃癌組織和正常胃黏膜組織標本使用10%中性甲醛固定，石蠟包埋。組織蠟塊切成4 μm厚薄片，經(jīng)脫蠟、水化后，放入枸櫞酸緩沖液內(nèi)，置于微波爐內(nèi)(95 ℃、15 min)修復(fù)抗原。在3%過氧化氫中孵育20 min，PBS液沖洗，使用免疫組化試劑盒中的血清封閉，分別滴加兔抗人FLNa一抗(1∶150)，在4 ℃冰箱內(nèi)過夜，PBS液沖洗，滴加組化試劑盒中生物素標記的相關(guān)二抗，放置在室溫30 min。PBS液沖洗，滴加用辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，放置于室溫30 min，PBS液沖洗，DAB液顯色，自來水清洗，經(jīng)蘇木精染色、脫水、二甲苯透明后，樹膠封片。用人子宮組織染色作為FLNa蛋白的陽性對照，PBS液代替一抗染色作為陰性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察FLNa蛋白的免疫組化結(jié)果，在高倍鏡下選擇5個視野計數(shù)，每個高倍視野下計數(shù)200個細胞，計算出平均細胞陽性率。染色強度分為淺染、淡黃和棕黃3個等級，顆粒狀態(tài)又分為無明顯顆粒、稀疏顆粒和彌漫性顆粒3種情況。綜合分析每張切片的陽性率及染色強度，將免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分為3級：陽性細胞數(shù)<25%，染色較淡，未見明顯顆粒者定為陰性；陽性細胞數(shù)25%～<50%，染色淡，可見稀疏顆粒者定為弱陽性；陽性細胞數(shù)≥50%，染色棕黃，可見彌漫性顆粒者定為強陽性。將弱陽性和強陽性均定義為陽性。由2名高資歷的病理醫(yī)師閱片，共同確定判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型，生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織和正常胃黏膜中FLNa表達比較 FLNa陽性表達定位于細胞質(zhì)。胃癌組織和正常胃黏膜中FLNa陽性表達率分別為47.1%(24/51)、90.2%(46/51)，兩者比較χ2=34.622,P=0.000。

2.2 胃癌組織中FLNa表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

2.3 胃癌組織中FLNa表達與患者生存預(yù)后的關(guān)系 將患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、腫瘤浸潤深度(侵及或未侵及漿膜)和FLNa表達(陽性與陰性)等因素進行Cox回歸分析，結(jié)果表明腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FLNa表達是影響胃癌患者術(shù)后預(yù)后的獨立因素，見表2。FLNa陽性、陰性表達者生存期分別為(60.9±2.1)、(23.8±2.2)月，兩組比較P=0.000。

表1 胃癌組織中FLNa表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

表2 胃癌患者預(yù)后相關(guān)影響因素的多因素分析

3 討論

FLNa屬非肌性肌動蛋白結(jié)合蛋白，是細絲蛋白家族成員，該基因表達廣泛，結(jié)構(gòu)保守，影響哺乳動物的生長發(fā)育。FLNa蛋白二聚體的亞基含有一個氨基端的肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個棒狀結(jié)構(gòu)域，間隔兩個分別由大約30個氨基酸殘基形成的鏈狀結(jié)構(gòu)，兩條多肽鏈在羧基端在第24個重復(fù)序列尾端相連接，構(gòu)成“V”形同源二聚體而發(fā)揮功能[6]。FLNa蛋白主要分布于細胞質(zhì)內(nèi)，蛋白結(jié)構(gòu)中的棒狀結(jié)構(gòu)中含有多重β-片層，是多種具有重要功能的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的界面，其中的多數(shù)蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)信號分子的膜受體，同時還兼有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)支架蛋白的功能，在細胞增殖、黏附、遷徙等多種行為中發(fā)揮重要作用[7]。

目前的研究證實，F(xiàn)LNa與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。史建偉等[8,9]將含有FLNa cDNA的質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細胞株，使其FLNa基因過表達，結(jié)果表明，F(xiàn)LNa抑制了SW480細胞株的體內(nèi)外侵襲能力。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中FLNa表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁浸潤和新輔助化療療效及預(yù)后有關(guān)。Xu等[11]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力。Sun等[12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa抑制人胃癌SGC-7901細胞株的體外侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Tian等[13]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa在結(jié)直腸癌中呈低表達，與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要指標。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測FLNa在胃癌組織和胃正常黏膜組織中的表達情況，結(jié)果證實癌組織中FLNa陽性表達率低于正常黏膜組織。進一步分析表明，F(xiàn)LNa的表達與患者是否存在肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤浸潤深度有關(guān)。并且多因素分析提示，F(xiàn)LNa表達是影響胃癌患者術(shù)后生存的獨立因素，生存分析發(fā)現(xiàn)FLNa陽性表達者術(shù)后生存期長于陰性表達者。

目前對FLNa抑癌的機制尚在研究中。Zhu等[14]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa以Ras-GRF1為中介調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)的Ras/ERK通路、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達，阻遏其對細胞外基質(zhì)的降解、降低腫瘤細胞的侵襲能力。Fiori等[15]發(fā)現(xiàn)，受表皮生長因子刺激的人黑色素瘤M2細胞(缺失FLNa)中表皮生長因子受體酪氨酸的泛素化水平較M2A7細胞(表達FLNa)低，深入研究后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa蛋白合成量減少影響表皮生長因子受體和泛素連接酶c-Cb1鏈間的相互作用，導(dǎo)致抗表皮生長因子誘導(dǎo)的表皮生長因子受體降解受到顯著的遏制，相反在表達FLNa的細胞中表皮生長因子受體的降解加速，據(jù)此推測FLNa通過抑制表皮生長因子受體的活性，達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。Zhou等[16]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa通過HGF/c-MET信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的遷移能力。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa通過降低MMP-9的表達而抑制前列腺癌細胞的侵襲力。此外，F(xiàn)eng等[18]通過使用酵母雙雜交實驗，并結(jié)合腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究方法證實，F(xiàn)LNa能夠特異性地與G蛋白耦聯(lián)受體、GTP結(jié)合蛋白結(jié)合，參與調(diào)節(jié)腫瘤的形成發(fā)展。

綜上所述，F(xiàn)LNa在胃癌組織中表達降低，與胃癌的形成和發(fā)展密切相關(guān)，并且可作為預(yù)后判斷的重要指標。