車雙雙 徐華 郭偉 孫磊 張鳴號 楊曉玲 姜怡鄧 劉志宏
寧夏醫(yī)科大學1公共衛(wèi)生與管理學院,3基礎醫(yī)學院(銀川750004);2寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室(銀川750004)
絲/蘇氨酸蛋白激酶(mammalian sterile 20?like kinase 1,MST1)是酵母Ste20 的哺乳動物同源物,具有高度的保守性。研究表明,MST1 可以在多種促凋亡刺激如十字孢堿、紫外線、血清饑餓以及抗腫瘤的藥物等情況下激活,引起下游信號分子活化,進而導致細胞凋亡[1],但有關其在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)中的功能研究報道甚少。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物,在體內(nèi)參與一碳單位的轉(zhuǎn)移。循證醫(yī)學證據(jù)顯示高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的獨立危險因子[2]。近年來,基礎研究證實Hcy 可以損傷血管HUVECs 功能,加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[3]。Hcy 通過甲硫氨酸循環(huán)影響基因DNA 甲基化水平參與疾病的發(fā)生,并已有文獻報道DNA 甲基化在Hcy 引起As 中起到重要作用[4]。但其是否影響MST1 的啟動子區(qū)甲基化水平,進而影響其表達變化目前仍不清楚。因此,本研究主要探討MST1 在Hcy 致HUVECs 損傷中的作用及其啟動子區(qū)DNA 甲基化的調(diào)控機制,為防治As 提供全新的視角及實驗依據(jù)。
1.1 主要實驗儀器和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(HUVECs,中國科學院細胞生物學研究所,中國);超凈工作臺(蘇州安泰,中國);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus,德國);實時熒光定量PCR 儀(Bio?Rad,美國);電泳儀(Bio?Rad,美國);凝膠成像儀(Bio?Rad,美國);RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國);青鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所,中國);Hcy(Sigma,美國);Annexin V?FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(貝博公司,中國);總RNA 提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司,中國);DNA 甲基化修飾試劑盒(ZYMORESEARCH,美國);逆轉(zhuǎn)錄和qRT?PCR 試劑盒(Thermo 公司,美國);蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(南京凱基有限公司,中國);MST1 兔抗人、鼠一抗(Abcam 公司,美國),辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,中國);引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 細胞分組及處理 用含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液,于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs。當細胞密度達到85%左右時,將細胞分為正常對照組(Control)組、Hcy 組(在培養(yǎng)液中加入Hcy,使其終濃度為100 μmol/L),每組為3 瓶,48 h 后收集細胞,用于后續(xù)實驗。
1.2.2 MTT 法檢測HUVECs 的活性 取對數(shù)生長期的細胞,制成1×105個/mL 細胞的懸液接種于96 孔板中,培養(yǎng)24 h 后,各組分別加入相應藥物孵育48 h,加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄液體,每孔加入150 μL DMSO 微量震蕩10 min,于酶標儀上490 nm測定各孔OD值,通過與Control 組比較求出存活率。存活率(%)=實驗組吸光度(A)值/Control 組吸光度(A)值×100%。
1.2.3 Hoechst染色法檢測細胞凋亡 生長融合后,按實驗分組并每組設3 個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h;吸盡培養(yǎng)液,用PBS 洗3 次,每次5 min,加入250 μL預冷的4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min;用PBS洗滌3 次,每次5 min,吸盡液體;加入Hoechst 33258 染色液(2 μg/mL),室溫避光孵育5 min;去染色液,PBS 洗3 次,每次5 min,在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)改變。
1.2.4 Western blot 檢測MST1、DNMT1、Bcl?2 及BAX 蛋白表達 按照試劑盒說明書提取HUVECs的總蛋白,各組樣本分別取30 μg 總蛋白,經(jīng)SDS?PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h 后,與MST1、DNMT1、Bcl?2 及BAX 抗體均勻混合后4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3 次,與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或鼠IgG 室溫下孵育2 h,加入ECL 顯色底物,凝膠成像分析儀上成像。設β?actin 為內(nèi)參,計算目的基因與β?actin 灰度值的比值,并進行分析。
1.2.5 巢式降落式甲基化特異性PCR(nMS?PCR)檢測MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化 按DNA提取試劑盒說明書提取各組細胞全基因組DNA,檢測OD260/OD280 值,分析全基因組DNA 樣品純度和濃度。亞硫酸鹽修飾法對全基因組DNA 進行甲基化修飾。nMS?PCR 法檢測MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化改變。針對MST1 啟動子區(qū),設計外引物及兩對內(nèi)引物:外引物:上游5′?AAAAATCTAC?TCATCAAATAAATAACTAAA?3′,下游5′?TTGTTG?GATAGT ATAAAGGTAGAA?3′;甲基化引物:上游5′?CGTTTGGGAGTTTAAGGACG?3′,下游5′?TAAA?CCTAACGAATTCCGACT?3′;非甲基化引物:上游5′?TGTTTGGGAGTTTAAGGATGG?3′,下游5′?CTC?TAAACCTAACAAATTCCAACT?3′。擴增反應條件:95 ℃5 min,95 ℃30 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s,20 個循環(huán),每個循環(huán)降0.5~56 ℃,72 ℃7 min。以外引物的PCR 產(chǎn)物為模板,進行內(nèi)引物的擴增,反應條件同外引物。取5 μL PCR 產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳,用凝膠成像分析儀成像并分析甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度,按如下公式進行結(jié)果的計算:非甲基化(%)=非甲基化(OD值)/[甲基化(OD值)+非甲基化(OD值)],每組實驗重復3 次。
1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩樣本均數(shù)間比較采用兩獨立樣本t檢驗,兩個變量相關性分析采用Pearson 相關系數(shù)分析,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。
2.1 Hcy 對HUVECs 存活率的影響 100 μmol/L Hcy 干預細胞48 h 后,MTT 法檢測各組細胞存活率。結(jié)果顯示:與Control 組比較,Hcy 組細胞增殖受到明顯抑制,其細胞存活率明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),結(jié)果提示Hcy 對HUVECs生長有抑制作用,見圖1。
圖1 Hcy 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率的影響Fig.1 Effect of Hcy on survival rate of HUVECs
2.2 Hoechst 33258 染色觀察HUVECs 核形態(tài)改變 細胞經(jīng)DNA熒光染料Hoechst 33258染色5 min后,于共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Control 組細胞核大小均一、核圓且規(guī)整,核膜光滑無皺縮;Hcy 組細胞核與細胞質(zhì)邊界模糊,胞核固縮,大小不一,呈現(xiàn)不規(guī)則形狀改變,見圖2。
圖2 各組核形態(tài)通過Hoechst 33258 染色檢測(×400)Fig.2 Nuclear morphology stained by Hoechst 33258 staining in each group
2.3 Hcy 對HUVECs 中Bcl?2 和BAX 表達的影響 為了進一步明確Hcy 在HUVECs 凋亡中的作用,Western blot 檢測了各組細胞中Bcl?2 和BAX 的蛋白表達水平(圖3A)。與Control 組相比,Hcy 刺激后,Bcl?2 的蛋白表達降低了11.04%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),BAX 的蛋白表達增加了1.23倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Bcl?2 與BAX的比率降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示Hcy 可能介導HUVECs 凋亡(圖3B)。
圖3 HUVECs 中Bcl?2 和BAX 的蛋白表達Fig.3 The protein expression of Bcl?2 and BAX in HUVECs
2.4 Hcy 干預HUVECs 后MST1 的蛋白表達 為了探討MST1 在Hcy 介導HUVECs 凋亡中的作用,Hcy 干預細胞后檢測MST1 的表達。結(jié)果顯示,與Control 組比較,Hcy 組MST1 蛋白表達水平為Con?trol 組的1.13 倍(P<0.01),表明MST1 的表達上調(diào)可能在高Hcy 介導HUVECs 凋亡中發(fā)揮著重要的作用,見圖4。
2.5 HUVECs 中MST1 表達與Bcl?2/BAX 的相關性分析 為進一步驗證MST1 與HUVECs 凋亡的相關性,將MST1 蛋白表達水平與Bcl?2/BAX 進行了相關性分析,結(jié)果顯示:細胞MST1 表達水平與Bcl?2/BAX 呈負相關(r2=0.844 6,P<0.001),提示MST1 與HUVECs 凋亡密切相關,見圖5。
圖4 HUVECs 中Hcy 對MST1 蛋白表達的影響Fig.4 The effect of Hcy on the protein expression of Bcl?2 and BAX in HUVECs
圖5 MST1 水平與Bcl?2/BAX 比值的相關性分析Fig.5 Analysis of correlation between MST1 protein levels and the ratio of Bcl?2/BAX
2.6 MST1 生物信息學分析 利用生物信息學軟件MethPrimer 分析MST1 啟動 子 區(qū)CpG 島,選取MST1 基因上游2 500 bp 作為研究對象,發(fā)現(xiàn)MST1啟動子區(qū)含有CPG島,分別位于?1516/?1459、?1368/?871、?850/?682,提示MST1 基因很可能受到甲基化的調(diào)控,見圖6。
圖6 MST1 啟動子區(qū)的生物信息學分析Fig.6 Bioformatics analysis of MST1 promoter region
2.7 Hcy 對HUVECs 中MST1 啟 動 子 區(qū)DNA 甲基化的影響 為探討Hcy 致HUVECs 凋亡中調(diào)控MST1 表達的機制,Hcy 干預HUVECs 后nMS?PCR法檢測MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化水平。結(jié)果顯示:與Control 組相比,Hcy 組MST1 DNA 甲基化水平明顯降低18.39%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示DNA 甲基化參與了MST1 的表達調(diào)控,見圖7。
2.8 Hcy 干預后DNMT1 蛋白表達的改變 100 μmol/L Hcy 處理HUVECs 48 h 后,Western blot 檢測了Control 組和Hcy 組中DNMT1 的蛋白表達。結(jié)果顯示:Hcy 干預后,DNMT1 蛋白表達顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示DNMT1 可能在MST1 的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用,見圖8。
動脈粥樣硬化(As)是心腦血管疾病共同的病理基礎,嚴重危害人類健康[5]。Hcy 是As 的獨立危險因子。研究報道,Hcy 致As 的機制涉及內(nèi)皮細胞損傷、VSMCs 增殖以及泡沫細胞的形成[6]。內(nèi)皮細胞損傷是As 形成的早期始動環(huán)節(jié),同時也是發(fā)生As 的必備條件。引起內(nèi)皮功能損傷的因素眾多,其中內(nèi)皮細胞凋亡是重要因素之一[7]。因此,深入研究其功能的改變及機制,具有潛在的臨床應用前景。
圖7 在HUVECs 中Hcy 誘導MST1 甲基化水平改變Fig.7 Hcy induced change of MST1 DNA methylation level in HUVECs
圖8 HUVECs 中Hcy 對DNMT1 表達的影響Fig.8 The effect of Hcy on the expression of DNMT1 in HUVECs
本文在前期研究的基礎上,篩選出100 μmol/L Hcy 的濃度對內(nèi)皮細胞增殖抑制率明顯升高[8],采用該濃度Hcy干預HUVECs 建立As體外實驗模型,以觀察Hcy 對HUVECs 凋亡的影響,并從內(nèi)皮細胞凋亡的角度探討Hcy 在As 中作用。實驗中可觀察到Hcy 能夠使HUVECs 存活率降低,對HUVECs 損傷具有促進作用。采用Hoechst 33258 細胞核熒光染色和Western blot 技術(shù)進一步觀察細胞的凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):Control 組細胞核呈微弱均勻藍色熒光;Hcy 組細胞核顯示較深藍色熒光狀,可見核固縮、凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學特征。細胞凋亡是一系列基因活動引起的級聯(lián)反應的結(jié)果,由誘導基因和抑制基因共同調(diào)控。Bcl?2 具有抗細胞凋亡的功能,它能通過抵抗多種形式的細胞凋亡延長細胞壽命。而BAX是Bcl?2的同源基因,其表達上調(diào)可拮抗Bcl?2 的保護效應使細胞趨于凋亡。細胞凋亡是否發(fā)生是由Bcl?2 和BAX 決定的[9]。Western blot 結(jié)果顯示,與Control 組比較,加入Hcy后,Bcl?2 的蛋白表達顯著降低,而Hcy 組中BAX的蛋白表達明顯增高,以上結(jié)果提示:Hcy 能夠誘導HUVECs 的凋亡。
MST1 是體內(nèi)普遍表達的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,主要參與細胞生長發(fā)育、細胞遷移和分化、增殖、凋亡以及器官大小等的調(diào)控[10]。有研究[11]表明,多種促凋亡刺激和細胞應激如紫外線照射、TNF?α 及抗腫瘤藥物可激活MST1,引起下游信號分子活化,進一步導致細胞凋亡。張輝等[12]研究發(fā)現(xiàn),MST1 基因在腎癌組織中表達明顯下調(diào),過表達MST1 后,可使腎癌凋亡明顯升高;有學者的研究也發(fā)現(xiàn),在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MST1 的HeLa 細胞中,可以加速caspase?3 的激活使得細胞對死亡受體介導的凋亡更敏感[2,13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control 組比較,Hcy 組細胞中MST1 蛋白表達明顯升高,與HUVECs 中Bcl?2 蛋白水平呈負相關,而與BAX 蛋白水平呈正相關,提示MST1 可能是促進HUVECs凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。
Hcy 是一種含硫的非必需氨基酸,其作為甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物,參與體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié),通過將甲基轉(zhuǎn)移至DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)揮生物學效應[14]。DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾,以未改變核苷酸順序及其組成的方式,影響DNA 構(gòu)象穩(wěn)定性,從而調(diào)控基因表達。一般情況下,DNA 甲基化誘導基因的表達沉默,而去甲基化則激活基因的表達[15]。前期研究發(fā)現(xiàn),在As 中Hcy 參與多種基因甲基化修飾狀態(tài)的改變。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)MST1 啟動子區(qū)富含CpG 位點,因此筆者推測,DNA 甲基化這一表觀遺傳學機制參與了Hcy 調(diào)控MST1 的表達進而促進HUVECs 凋亡,為了驗證這一假設,本課題組進一步檢測Hcy 干預后MST1 啟動子區(qū)甲基化程度的改變。結(jié)果顯示,Hcy 組細胞中MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化程度明顯降低,DNA 低甲基化作為基因轉(zhuǎn)錄增強的重要標志之一,與MST1 表達水平上調(diào)相一致。同時,本研究發(fā)現(xiàn)Hcy 干預后HUVECs中DNMT1 表達降低,其主要原因是DNA 甲基化主要是通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族(DNMTs)催化發(fā)生并維持的,而DNMT1 是哺乳動物體內(nèi)含量最多的一種DNMTs[3,16],其表達降低,會導致DNA 低甲基化、基因的表達激活,從而誘導細胞的凋亡改變。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,Hcy 通過下調(diào)DNMT1 表達導致MST1 基因啟動子區(qū)DNA 甲基化水平降低,進而引起MST1 的表達升高,促進HU?VECs 凋亡。因此,繼續(xù)對MST1 在Hcy 誘導的HU?VECs 凋亡調(diào)控機制中的深入研究,將有望為防治As 找到新的靶點和方向。