• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    絲/蘇氨酸蛋白激酶DNA 甲基化在同型半胱氨酸致血管內(nèi)皮細胞凋亡中的作用

    2019-04-02 07:43:32車雙雙徐華郭偉孫磊張鳴號楊曉玲姜怡鄧劉志宏
    實用醫(yī)學雜志 2019年5期
    關鍵詞:甲基化存活率內(nèi)皮細胞

    車雙雙 徐華 郭偉 孫磊 張鳴號 楊曉玲 姜怡鄧 劉志宏

    寧夏醫(yī)科大學1公共衛(wèi)生與管理學院,3基礎醫(yī)學院(銀川750004);2寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室(銀川750004)

    絲/蘇氨酸蛋白激酶(mammalian sterile 20?like kinase 1,MST1)是酵母Ste20 的哺乳動物同源物,具有高度的保守性。研究表明,MST1 可以在多種促凋亡刺激如十字孢堿、紫外線、血清饑餓以及抗腫瘤的藥物等情況下激活,引起下游信號分子活化,進而導致細胞凋亡[1],但有關其在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVECs)中的功能研究報道甚少。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物,在體內(nèi)參與一碳單位的轉(zhuǎn)移。循證醫(yī)學證據(jù)顯示高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的獨立危險因子[2]。近年來,基礎研究證實Hcy 可以損傷血管HUVECs 功能,加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[3]。Hcy 通過甲硫氨酸循環(huán)影響基因DNA 甲基化水平參與疾病的發(fā)生,并已有文獻報道DNA 甲基化在Hcy 引起As 中起到重要作用[4]。但其是否影響MST1 的啟動子區(qū)甲基化水平,進而影響其表達變化目前仍不清楚。因此,本研究主要探討MST1 在Hcy 致HUVECs 損傷中的作用及其啟動子區(qū)DNA 甲基化的調(diào)控機制,為防治As 提供全新的視角及實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要實驗儀器和試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(HUVECs,中國科學院細胞生物學研究所,中國);超凈工作臺(蘇州安泰,中國);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus,德國);實時熒光定量PCR 儀(Bio?Rad,美國);電泳儀(Bio?Rad,美國);凝膠成像儀(Bio?Rad,美國);RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國);青鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所,中國);Hcy(Sigma,美國);Annexin V?FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(貝博公司,中國);總RNA 提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司,中國);DNA 甲基化修飾試劑盒(ZYMORESEARCH,美國);逆轉(zhuǎn)錄和qRT?PCR 試劑盒(Thermo 公司,美國);蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(南京凱基有限公司,中國);MST1 兔抗人、鼠一抗(Abcam 公司,美國),辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,中國);引物由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞分組及處理 用含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液,于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs。當細胞密度達到85%左右時,將細胞分為正常對照組(Control)組、Hcy 組(在培養(yǎng)液中加入Hcy,使其終濃度為100 μmol/L),每組為3 瓶,48 h 后收集細胞,用于后續(xù)實驗。

    1.2.2 MTT 法檢測HUVECs 的活性 取對數(shù)生長期的細胞,制成1×105個/mL 細胞的懸液接種于96 孔板中,培養(yǎng)24 h 后,各組分別加入相應藥物孵育48 h,加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄液體,每孔加入150 μL DMSO 微量震蕩10 min,于酶標儀上490 nm測定各孔OD值,通過與Control 組比較求出存活率。存活率(%)=實驗組吸光度(A)值/Control 組吸光度(A)值×100%。

    1.2.3 Hoechst染色法檢測細胞凋亡 生長融合后,按實驗分組并每組設3 個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h;吸盡培養(yǎng)液,用PBS 洗3 次,每次5 min,加入250 μL預冷的4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min;用PBS洗滌3 次,每次5 min,吸盡液體;加入Hoechst 33258 染色液(2 μg/mL),室溫避光孵育5 min;去染色液,PBS 洗3 次,每次5 min,在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)改變。

    1.2.4 Western blot 檢測MST1、DNMT1、Bcl?2 及BAX 蛋白表達 按照試劑盒說明書提取HUVECs的總蛋白,各組樣本分別取30 μg 總蛋白,經(jīng)SDS?PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h 后,與MST1、DNMT1、Bcl?2 及BAX 抗體均勻混合后4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3 次,與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或鼠IgG 室溫下孵育2 h,加入ECL 顯色底物,凝膠成像分析儀上成像。設β?actin 為內(nèi)參,計算目的基因與β?actin 灰度值的比值,并進行分析。

    1.2.5 巢式降落式甲基化特異性PCR(nMS?PCR)檢測MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化 按DNA提取試劑盒說明書提取各組細胞全基因組DNA,檢測OD260/OD280 值,分析全基因組DNA 樣品純度和濃度。亞硫酸鹽修飾法對全基因組DNA 進行甲基化修飾。nMS?PCR 法檢測MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化改變。針對MST1 啟動子區(qū),設計外引物及兩對內(nèi)引物:外引物:上游5′?AAAAATCTAC?TCATCAAATAAATAACTAAA?3′,下游5′?TTGTTG?GATAGT ATAAAGGTAGAA?3′;甲基化引物:上游5′?CGTTTGGGAGTTTAAGGACG?3′,下游5′?TAAA?CCTAACGAATTCCGACT?3′;非甲基化引物:上游5′?TGTTTGGGAGTTTAAGGATGG?3′,下游5′?CTC?TAAACCTAACAAATTCCAACT?3′。擴增反應條件:95 ℃5 min,95 ℃30 s,65 ℃30 s,72 ℃30 s,20 個循環(huán),每個循環(huán)降0.5~56 ℃,72 ℃7 min。以外引物的PCR 產(chǎn)物為模板,進行內(nèi)引物的擴增,反應條件同外引物。取5 μL PCR 產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳,用凝膠成像分析儀成像并分析甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度,按如下公式進行結(jié)果的計算:非甲基化(%)=非甲基化(OD值)/[甲基化(OD值)+非甲基化(OD值)],每組實驗重復3 次。

    1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩樣本均數(shù)間比較采用兩獨立樣本t檢驗,兩個變量相關性分析采用Pearson 相關系數(shù)分析,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Hcy 對HUVECs 存活率的影響 100 μmol/L Hcy 干預細胞48 h 后,MTT 法檢測各組細胞存活率。結(jié)果顯示:與Control 組比較,Hcy 組細胞增殖受到明顯抑制,其細胞存活率明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),結(jié)果提示Hcy 對HUVECs生長有抑制作用,見圖1。

    圖1 Hcy 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率的影響Fig.1 Effect of Hcy on survival rate of HUVECs

    2.2 Hoechst 33258 染色觀察HUVECs 核形態(tài)改變 細胞經(jīng)DNA熒光染料Hoechst 33258染色5 min后,于共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Control 組細胞核大小均一、核圓且規(guī)整,核膜光滑無皺縮;Hcy 組細胞核與細胞質(zhì)邊界模糊,胞核固縮,大小不一,呈現(xiàn)不規(guī)則形狀改變,見圖2。

    圖2 各組核形態(tài)通過Hoechst 33258 染色檢測(×400)Fig.2 Nuclear morphology stained by Hoechst 33258 staining in each group

    2.3 Hcy 對HUVECs 中Bcl?2 和BAX 表達的影響 為了進一步明確Hcy 在HUVECs 凋亡中的作用,Western blot 檢測了各組細胞中Bcl?2 和BAX 的蛋白表達水平(圖3A)。與Control 組相比,Hcy 刺激后,Bcl?2 的蛋白表達降低了11.04%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),BAX 的蛋白表達增加了1.23倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Bcl?2 與BAX的比率降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示Hcy 可能介導HUVECs 凋亡(圖3B)。

    圖3 HUVECs 中Bcl?2 和BAX 的蛋白表達Fig.3 The protein expression of Bcl?2 and BAX in HUVECs

    2.4 Hcy 干預HUVECs 后MST1 的蛋白表達 為了探討MST1 在Hcy 介導HUVECs 凋亡中的作用,Hcy 干預細胞后檢測MST1 的表達。結(jié)果顯示,與Control 組比較,Hcy 組MST1 蛋白表達水平為Con?trol 組的1.13 倍(P<0.01),表明MST1 的表達上調(diào)可能在高Hcy 介導HUVECs 凋亡中發(fā)揮著重要的作用,見圖4。

    2.5 HUVECs 中MST1 表達與Bcl?2/BAX 的相關性分析 為進一步驗證MST1 與HUVECs 凋亡的相關性,將MST1 蛋白表達水平與Bcl?2/BAX 進行了相關性分析,結(jié)果顯示:細胞MST1 表達水平與Bcl?2/BAX 呈負相關(r2=0.844 6,P<0.001),提示MST1 與HUVECs 凋亡密切相關,見圖5。

    圖4 HUVECs 中Hcy 對MST1 蛋白表達的影響Fig.4 The effect of Hcy on the protein expression of Bcl?2 and BAX in HUVECs

    圖5 MST1 水平與Bcl?2/BAX 比值的相關性分析Fig.5 Analysis of correlation between MST1 protein levels and the ratio of Bcl?2/BAX

    2.6 MST1 生物信息學分析 利用生物信息學軟件MethPrimer 分析MST1 啟動 子 區(qū)CpG 島,選取MST1 基因上游2 500 bp 作為研究對象,發(fā)現(xiàn)MST1啟動子區(qū)含有CPG島,分別位于?1516/?1459、?1368/?871、?850/?682,提示MST1 基因很可能受到甲基化的調(diào)控,見圖6。

    圖6 MST1 啟動子區(qū)的生物信息學分析Fig.6 Bioformatics analysis of MST1 promoter region

    2.7 Hcy 對HUVECs 中MST1 啟 動 子 區(qū)DNA 甲基化的影響 為探討Hcy 致HUVECs 凋亡中調(diào)控MST1 表達的機制,Hcy 干預HUVECs 后nMS?PCR法檢測MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化水平。結(jié)果顯示:與Control 組相比,Hcy 組MST1 DNA 甲基化水平明顯降低18.39%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示DNA 甲基化參與了MST1 的表達調(diào)控,見圖7。

    2.8 Hcy 干預后DNMT1 蛋白表達的改變 100 μmol/L Hcy 處理HUVECs 48 h 后,Western blot 檢測了Control 組和Hcy 組中DNMT1 的蛋白表達。結(jié)果顯示:Hcy 干預后,DNMT1 蛋白表達顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示DNMT1 可能在MST1 的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用,見圖8。

    3 討論

    動脈粥樣硬化(As)是心腦血管疾病共同的病理基礎,嚴重危害人類健康[5]。Hcy 是As 的獨立危險因子。研究報道,Hcy 致As 的機制涉及內(nèi)皮細胞損傷、VSMCs 增殖以及泡沫細胞的形成[6]。內(nèi)皮細胞損傷是As 形成的早期始動環(huán)節(jié),同時也是發(fā)生As 的必備條件。引起內(nèi)皮功能損傷的因素眾多,其中內(nèi)皮細胞凋亡是重要因素之一[7]。因此,深入研究其功能的改變及機制,具有潛在的臨床應用前景。

    圖7 在HUVECs 中Hcy 誘導MST1 甲基化水平改變Fig.7 Hcy induced change of MST1 DNA methylation level in HUVECs

    圖8 HUVECs 中Hcy 對DNMT1 表達的影響Fig.8 The effect of Hcy on the expression of DNMT1 in HUVECs

    本文在前期研究的基礎上,篩選出100 μmol/L Hcy 的濃度對內(nèi)皮細胞增殖抑制率明顯升高[8],采用該濃度Hcy干預HUVECs 建立As體外實驗模型,以觀察Hcy 對HUVECs 凋亡的影響,并從內(nèi)皮細胞凋亡的角度探討Hcy 在As 中作用。實驗中可觀察到Hcy 能夠使HUVECs 存活率降低,對HUVECs 損傷具有促進作用。采用Hoechst 33258 細胞核熒光染色和Western blot 技術(shù)進一步觀察細胞的凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):Control 組細胞核呈微弱均勻藍色熒光;Hcy 組細胞核顯示較深藍色熒光狀,可見核固縮、凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學特征。細胞凋亡是一系列基因活動引起的級聯(lián)反應的結(jié)果,由誘導基因和抑制基因共同調(diào)控。Bcl?2 具有抗細胞凋亡的功能,它能通過抵抗多種形式的細胞凋亡延長細胞壽命。而BAX是Bcl?2的同源基因,其表達上調(diào)可拮抗Bcl?2 的保護效應使細胞趨于凋亡。細胞凋亡是否發(fā)生是由Bcl?2 和BAX 決定的[9]。Western blot 結(jié)果顯示,與Control 組比較,加入Hcy后,Bcl?2 的蛋白表達顯著降低,而Hcy 組中BAX的蛋白表達明顯增高,以上結(jié)果提示:Hcy 能夠誘導HUVECs 的凋亡。

    MST1 是體內(nèi)普遍表達的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,主要參與細胞生長發(fā)育、細胞遷移和分化、增殖、凋亡以及器官大小等的調(diào)控[10]。有研究[11]表明,多種促凋亡刺激和細胞應激如紫外線照射、TNF?α 及抗腫瘤藥物可激活MST1,引起下游信號分子活化,進一步導致細胞凋亡。張輝等[12]研究發(fā)現(xiàn),MST1 基因在腎癌組織中表達明顯下調(diào),過表達MST1 后,可使腎癌凋亡明顯升高;有學者的研究也發(fā)現(xiàn),在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MST1 的HeLa 細胞中,可以加速caspase?3 的激活使得細胞對死亡受體介導的凋亡更敏感[2,13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control 組比較,Hcy 組細胞中MST1 蛋白表達明顯升高,與HUVECs 中Bcl?2 蛋白水平呈負相關,而與BAX 蛋白水平呈正相關,提示MST1 可能是促進HUVECs凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。

    Hcy 是一種含硫的非必需氨基酸,其作為甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物,參與體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié),通過將甲基轉(zhuǎn)移至DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)揮生物學效應[14]。DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾,以未改變核苷酸順序及其組成的方式,影響DNA 構(gòu)象穩(wěn)定性,從而調(diào)控基因表達。一般情況下,DNA 甲基化誘導基因的表達沉默,而去甲基化則激活基因的表達[15]。前期研究發(fā)現(xiàn),在As 中Hcy 參與多種基因甲基化修飾狀態(tài)的改變。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)MST1 啟動子區(qū)富含CpG 位點,因此筆者推測,DNA 甲基化這一表觀遺傳學機制參與了Hcy 調(diào)控MST1 的表達進而促進HUVECs 凋亡,為了驗證這一假設,本課題組進一步檢測Hcy 干預后MST1 啟動子區(qū)甲基化程度的改變。結(jié)果顯示,Hcy 組細胞中MST1 啟動子區(qū)DNA 甲基化程度明顯降低,DNA 低甲基化作為基因轉(zhuǎn)錄增強的重要標志之一,與MST1 表達水平上調(diào)相一致。同時,本研究發(fā)現(xiàn)Hcy 干預后HUVECs中DNMT1 表達降低,其主要原因是DNA 甲基化主要是通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族(DNMTs)催化發(fā)生并維持的,而DNMT1 是哺乳動物體內(nèi)含量最多的一種DNMTs[3,16],其表達降低,會導致DNA 低甲基化、基因的表達激活,從而誘導細胞的凋亡改變。

    綜上所述,本研究結(jié)果表明,Hcy 通過下調(diào)DNMT1 表達導致MST1 基因啟動子區(qū)DNA 甲基化水平降低,進而引起MST1 的表達升高,促進HU?VECs 凋亡。因此,繼續(xù)對MST1 在Hcy 誘導的HU?VECs 凋亡調(diào)控機制中的深入研究,將有望為防治As 找到新的靶點和方向。

    猜你喜歡
    甲基化存活率內(nèi)皮細胞
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    損耗率高達30%,保命就是保收益!這條70萬噸的魚要如何破存活率困局?
    淺議角膜內(nèi)皮細胞檢查
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預計年產(chǎn)3.5萬斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    雌激素治療保護去卵巢對血管內(nèi)皮細胞損傷的初步機制
    細胞微泡miRNA對內(nèi)皮細胞的調(diào)控
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進展
    痰瘀與血管內(nèi)皮細胞的關系研究
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    久久久久国内视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费搜索国产男女视频| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩强制内射视频| 九色成人免费人妻av| 深夜精品福利| 亚洲精品色激情综合| 久久99热这里只有精品18| 色噜噜av男人的天堂激情| 日本 av在线| 色在线成人网| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜福利成人在线免费观看| 久9热在线精品视频| 欧美性感艳星| 99久久精品热视频| 国产高潮美女av| 国产伦精品一区二区三区四那| 成熟少妇高潮喷水视频| 国模一区二区三区四区视频| 国产成人福利小说| 男女下面进入的视频免费午夜| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲最大成人中文| 中文资源天堂在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 无人区码免费观看不卡| 久久99热6这里只有精品| 极品教师在线视频| 春色校园在线视频观看| 国产精华一区二区三区| 性色avwww在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产av一区在线观看免费| 人妻久久中文字幕网| 两人在一起打扑克的视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久午夜福利片| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品一区二区免费观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 悠悠久久av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美高清成人免费视频www| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品伦人一区二区| 三级毛片av免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| а√天堂www在线а√下载| 免费大片18禁| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产精品成人综合色| 两个人视频免费观看高清| 嫩草影院新地址| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美成人a在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 午夜福利高清视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 特级一级黄色大片| 特级一级黄色大片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产在视频线在精品| 国产中年淑女户外野战色| 久久6这里有精品| 日韩欧美免费精品| 亚洲av成人av| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲av中文av极速乱 | 国产 一区精品| 嫩草影视91久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 熟女电影av网| 亚洲av二区三区四区| 亚洲性久久影院| 99久久成人亚洲精品观看| 国产成人av教育| 午夜免费激情av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 九色成人免费人妻av| 美女黄网站色视频| 国产高清激情床上av| 黄片wwwwww| 精华霜和精华液先用哪个| 搡老岳熟女国产| 五月伊人婷婷丁香| 成人三级黄色视频| 精品国产三级普通话版| 一a级毛片在线观看| 草草在线视频免费看| 久久这里只有精品中国| 欧美精品国产亚洲| 少妇的逼好多水| 有码 亚洲区| 国产精品人妻久久久影院| 极品教师在线免费播放| av在线天堂中文字幕| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 天堂动漫精品| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av一区综合| 天美传媒精品一区二区| 日本免费a在线| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 熟女电影av网| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99视频精品全部免费 在线| 黄色一级大片看看| 欧美激情久久久久久爽电影| 老司机深夜福利视频在线观看| 在线国产一区二区在线| 国产精品野战在线观看| 免费在线观看日本一区| 淫妇啪啪啪对白视频| 真实男女啪啪啪动态图| 在线播放国产精品三级| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 国产伦在线观看视频一区| 三级国产精品欧美在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产视频一区二区在线看| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品久久久久久,| 午夜福利18| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩强制内射视频| 午夜老司机福利剧场| 久久久国产成人免费| 免费看av在线观看网站| 日本三级黄在线观看| 国产成人a区在线观看| 少妇的逼水好多| 国产高清不卡午夜福利| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品91蜜桃| 1000部很黄的大片| 日日啪夜夜撸| eeuss影院久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产私拍福利视频在线观看| 免费高清视频大片| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品女同一区二区软件 | 欧美中文日本在线观看视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 一本精品99久久精品77| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 全区人妻精品视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚州av有码| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美黑人巨大hd| 精品欧美国产一区二区三| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜视频国产福利| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲电影在线观看av| 嫩草影视91久久| 婷婷六月久久综合丁香| 99在线人妻在线中文字幕| 最近视频中文字幕2019在线8| 日韩av在线大香蕉| 最近在线观看免费完整版| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产av一区在线观看免费| 成人欧美大片| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| av天堂在线播放| 国产精品一及| 亚洲av第一区精品v没综合| 美女cb高潮喷水在线观看| 一级黄片播放器| 如何舔出高潮| 真实男女啪啪啪动态图| 伦精品一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 最好的美女福利视频网| 精品午夜福利在线看| 欧美激情在线99| 精品无人区乱码1区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲在线自拍视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久99热这里只有精品18| 免费大片18禁| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲人成网站在线播| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩精品中文字幕看吧| 日韩人妻高清精品专区| 日日撸夜夜添| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产亚洲精品久久久com| 最新在线观看一区二区三区| 久久久精品大字幕| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av五月六月丁香网| 悠悠久久av| 国产精品无大码| 一区福利在线观看| 深夜精品福利| 欧美激情在线99| 韩国av在线不卡| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美+日韩+精品| 免费av不卡在线播放| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久精品国产自在天天线| 天堂√8在线中文| 欧美成人a在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人欧美大片| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 婷婷六月久久综合丁香| 淫秽高清视频在线观看| 三级毛片av免费| 国产精品野战在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产成人福利小说| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 丝袜美腿在线中文| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久久久久久久久丰满 | 欧美最新免费一区二区三区| 两个人视频免费观看高清| 国产精品一区www在线观看 | 国产av在哪里看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 可以在线观看的亚洲视频| 天堂影院成人在线观看| 日本熟妇午夜| 午夜影院日韩av| 久久久久久大精品| 99riav亚洲国产免费| 国产精品伦人一区二区| 亚洲成av人片在线播放无| 日韩一本色道免费dvd| 国产av不卡久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品人妻视频免费看| 亚州av有码| 亚洲av熟女| 国内精品久久久久久久电影| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美日韩黄片免| 亚洲综合色惰| 男女视频在线观看网站免费| x7x7x7水蜜桃| 麻豆一二三区av精品| 我的老师免费观看完整版| 国产主播在线观看一区二区| 日韩av在线大香蕉| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 午夜免费成人在线视频| 变态另类丝袜制服| 国产成人av教育| 少妇的逼水好多| 我的老师免费观看完整版| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美激情在线99| 国产亚洲欧美98| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一进一出抽搐gif免费好疼| 色综合站精品国产| 成年人黄色毛片网站| 亚洲不卡免费看| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧美日韩无卡精品| 69人妻影院| 91精品国产九色| 国产精品野战在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 日韩欧美 国产精品| 色综合婷婷激情| 国产主播在线观看一区二区| 极品教师在线视频| 九色国产91popny在线| 波多野结衣巨乳人妻| 黄色日韩在线| 亚洲精品在线观看二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美成人性av电影在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 成人国产一区最新在线观看| 国产成人福利小说| 精品一区二区三区视频在线| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品91蜜桃| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美zozozo另类| 成人亚洲精品av一区二区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 变态另类丝袜制服| 国产淫片久久久久久久久| 免费人成在线观看视频色| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲无线在线观看| 午夜激情欧美在线| 少妇的逼水好多| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产成年人精品一区二区| 亚洲国产色片| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99热网站在线观看| 日本 欧美在线| xxxwww97欧美| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲经典国产精华液单| 最新中文字幕久久久久| 毛片一级片免费看久久久久 | 中出人妻视频一区二区| .国产精品久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 91狼人影院| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日韩av在线大香蕉| av黄色大香蕉| 精品一区二区三区人妻视频| 极品教师在线免费播放| 亚洲图色成人| 动漫黄色视频在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 日本一二三区视频观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 此物有八面人人有两片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 在线播放国产精品三级| 亚洲专区中文字幕在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲人成网站在线播| 永久网站在线| 有码 亚洲区| 国产日本99.免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品乱码一区二三区的特点| 波多野结衣高清无吗| 亚洲精品国产成人久久av| 国产69精品久久久久777片| 波野结衣二区三区在线| 天堂动漫精品| 最近在线观看免费完整版| 免费观看精品视频网站| 神马国产精品三级电影在线观看| 免费观看人在逋| 极品教师在线视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲综合色惰| 成人av在线播放网站| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲美女视频黄频| 日本欧美国产在线视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩av在线大香蕉| 联通29元200g的流量卡| 亚洲自拍偷在线| 99riav亚洲国产免费| 免费人成在线观看视频色| 成人av一区二区三区在线看| 午夜影院日韩av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 九色国产91popny在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产麻豆成人av免费视频| 一个人看视频在线观看www免费| 婷婷六月久久综合丁香| 毛片女人毛片| 18+在线观看网站| 久久久成人免费电影| 国产精品一区www在线观看 | 精品国产三级普通话版| 亚洲成人久久爱视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久精品影院6| 欧美中文日本在线观看视频| 久久香蕉精品热| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久久久久久黄片| 午夜激情福利司机影院| 一个人看的www免费观看视频| 深夜精品福利| 很黄的视频免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 我的老师免费观看完整版| av在线天堂中文字幕| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 91av网一区二区| 在现免费观看毛片| 欧美激情久久久久久爽电影| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 成人午夜高清在线视频| 中文字幕久久专区| 少妇人妻一区二区三区视频| 男插女下体视频免费在线播放| 尾随美女入室| 99在线人妻在线中文字幕| 99热这里只有精品一区| 一级黄色大片毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲自偷自拍三级| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品人妻久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 毛片女人毛片| 搞女人的毛片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 极品教师在线视频| 身体一侧抽搐| 亚洲最大成人av| 午夜久久久久精精品| 亚洲av中文av极速乱 | 国产伦精品一区二区三区四那| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲在线自拍视频| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产精品电影一区二区三区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品欧美国产一区二区三| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久国产成人精品二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 中文亚洲av片在线观看爽| avwww免费| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 91久久精品国产一区二区成人| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 午夜激情福利司机影院| 九九在线视频观看精品| 免费大片18禁| 国产探花在线观看一区二区| 搡老岳熟女国产| 免费在线观看成人毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久九九热精品免费| 又紧又爽又黄一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产av麻豆久久久久久久| 99久久精品热视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久免费精品人妻一区二区| 九色成人免费人妻av| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品无大码| 午夜爱爱视频在线播放| 色哟哟哟哟哟哟| 成人无遮挡网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 99九九线精品视频在线观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 99热只有精品国产| 国产单亲对白刺激| 亚洲av中文av极速乱 | 免费av不卡在线播放| 我要搜黄色片| 国产亚洲精品av在线| 有码 亚洲区| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久这里只有精品中国| 成人二区视频| 亚洲真实伦在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产乱人视频| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲av二区三区四区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费人成在线观看视频色| 深夜精品福利| 久久久久精品国产欧美久久久| 黄片wwwwww| 如何舔出高潮| 亚洲欧美日韩无卡精品| 很黄的视频免费| 国产乱人视频| 久99久视频精品免费| 91久久精品电影网| 日韩亚洲欧美综合| 国产午夜福利久久久久久| 精品久久久久久久末码| 黄色一级大片看看| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日本视频| 91久久精品国产一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 男女那种视频在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 精品久久久久久成人av| 少妇丰满av| 婷婷丁香在线五月| 日本色播在线视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 日日啪夜夜撸| 99热这里只有是精品在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 久久久久久久久久成人| 99九九线精品视频在线观看视频| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 一个人看视频在线观看www免费| 我要搜黄色片| 国产免费男女视频| 18禁在线播放成人免费| 国产精品人妻久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产黄a三级三级三级人| 国产欧美日韩精品一区二区| 少妇的逼好多水| 美女被艹到高潮喷水动态| 精品久久国产蜜桃| 中文字幕高清在线视频| 综合色av麻豆| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 91狼人影院| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日本黄大片高清| 99精品久久久久人妻精品| 国产高潮美女av| 久久九九热精品免费| 国产精品综合久久久久久久免费| xxxwww97欧美| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 窝窝影院91人妻| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美潮喷喷水| 男女边吃奶边做爰视频| 中文字幕久久专区| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 免费看光身美女| 两个人视频免费观看高清| 欧美不卡视频在线免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲中文字幕日韩| 久久久色成人| 91久久精品电影网| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 最好的美女福利视频网| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品成人久久久久久| 99热这里只有精品一区| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久精品大字幕| 综合色av麻豆| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲七黄色美女视频| 国语自产精品视频在线第100页| 天天躁日日操中文字幕| 在线a可以看的网站| 嫁个100分男人电影在线观看| 日本黄大片高清| 很黄的视频免费| 欧美bdsm另类| 国产精品久久电影中文字幕| 99热网站在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 国产av不卡久久| 日韩欧美在线乱码| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲国产精品合色在线|