神經(jīng)肽Y雙側(cè)室旁核顯微注射在瘦素調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠交感神經(jīng)活性和壓力反射功能中的作用

李寶新，郭淑芹，董越華，辛歡歡，常文龍，王翯，李娜，田茜，張?jiān)屏?/p>

(1保定市第一中心醫(yī)院，河北保定 071000；2河北醫(yī)科大學(xué))

糖尿病與交感神經(jīng)活性(SNA)增強(qiáng)均影響著高血壓的發(fā)生和發(fā)展[1,2]。瘦素(LPN)是由白色脂肪分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌因子，與肥胖、能量代謝等密切相關(guān)，能激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，使壓力敏感性降低[3]，與糖尿病和高血壓的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。神經(jīng)肽Y(NPY)為與動物攝食、能量平衡及肥胖等相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，LPN參與機(jī)體能量的調(diào)節(jié)可能是通過下丘腦NPY實(shí)現(xiàn)的。LPN可與NPY神經(jīng)元上的LPN受體結(jié)合，抑制NPY合成與分泌，腦室內(nèi)輸入LPN可抑制NPY的表達(dá)[4,5]。有研究報道，在側(cè)腦室輸注NPY可降低血壓、心率及SNA[6]。因此，NPY可能參與LPN對糖尿病與高血壓的調(diào)節(jié)機(jī)制，但其具體作用部位尚未明確，且對壓力感受性反射功能影響尚不清楚。2016年4月～2017年10月，本研究探討了NPY調(diào)節(jié)LPN對2型糖尿病大鼠SNA和壓力感受性反射功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物室，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫保持在18～20 ℃?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。Biopac MP100數(shù)據(jù)獲得和分析系統(tǒng)(美國Biopac Systems公司)，α-氯醛糖(美國Sigma公司)，異氟醚(美國Sigma公司)，瘦素(美國R&D Systems公司)，NPYx(英國Tocris Bioscience公司)。

1.2 2型糖尿病模型的制備 實(shí)驗(yàn)期間給予20只SD大鼠高糖高脂飼料(常規(guī)飼料中加入20%蔗糖、15%熟豬油、2.5%膽固醇)喂養(yǎng)8周，禁食12 h后左下腹腔給予鏈脲佐菌素(0.1 mmol/L，檸檬酸鈉配制，pH 4.2)30 mg/kg注射。于實(shí)驗(yàn)第9周末選取尾靜脈空腹血糖≥7.8 mmol/L且伴有胰島素抵抗者作為2型糖尿病動物模型[7]，2只大鼠血糖未達(dá)標(biāo)予以淘汰。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將18只2型糖尿病大鼠依據(jù)室旁核顯微注射人工腦脊液(aCSF)和NPY受體激動劑NPYx隨機(jī)分為PVN-aCSF組和PVN-NPYx組，每組9只。

1.4 SNA和壓力感受性反射功能觀察 兩組均予5%異氟醚誘導(dǎo)麻醉，氧氣吸入后逐漸減為2%異氟醚維持。使用直腸熱敏電阻監(jiān)測，體溫保持在(37±1)℃。氣管插管保持人工通氣，然后股動脈(1支)和股靜脈(3支)導(dǎo)管植入用于監(jiān)測動脈壓和藥物輸注。在下腹部取正中切口，找到腰椎神經(jīng)，應(yīng)用輕量級有機(jī)硅材、雙極不銹鋼電極定位和液體膠定位和固定神經(jīng)，以電腦顯示出現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)信號為準(zhǔn)，然后應(yīng)用立體定位儀定位側(cè)腦室和室旁核注射部位，大鼠需穩(wěn)定60 min以上開始進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。①兩組基礎(chǔ)SNA、平均動脈壓(MAP)、心率(HR)應(yīng)用Biopac MP100數(shù)據(jù)獲得和分析系統(tǒng)記錄,2 000 Hz進(jìn)行采樣。SNA經(jīng)帶通濾過和放大，數(shù)據(jù)采集后SNA信號整合成1 s，以%表示。壓力感受性反射曲線是靜脈微量注射泵注射硝普鈉使血壓快速下降至50 mmHg，而后應(yīng)用鹽酸苯腎上腺素使血壓緩慢上升，3～5 min升至175 mmHg，觀察由血壓、HR變化而形成的擬合S曲線。根據(jù)基礎(chǔ)數(shù)值(SNA、MAP、HR)，繪制基礎(chǔ)壓力感受性反射曲線。MAP、HR、SNA在反射曲線中的關(guān)系是應(yīng)用Boltzmann方程進(jìn)行比較的：HR或SNA=(P1-P2)/[1+exp(MAP-P3)/P4]+P2。P1是HR或SNA最大值(Max),P2是HR或SNA最小值(Min),P3是MAP在HR或SNA取中值時的血壓(BP50),P4是寬度。baroreflex最大值、最小值和中點(diǎn)均在曲線圖中標(biāo)出。壓力感受性反射功能變化由SNA壓力反射曲線中的Max、Min和BP50來反映和表示[8]。②應(yīng)用立體定位儀定位大鼠頭部，使其暴露出扁平的頭骨，使用前囟和硬膜的背表面為基準(zhǔn)(計為零)，帶有細(xì)小管尖的單筒玻璃移液管用于側(cè)腦室輸注LPN(5 μg/h)。套管定位坐標(biāo)如下(毫米前囟)：尾1.0 mm，側(cè)1.4 mm，背4.2 mm。輸注1 h后(T1)，繪制壓力感受性反射曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將2.5%阿利新藍(lán)溶解在醋酸鈉中注入100 nL，去除腦后發(fā)現(xiàn)腦室有染料存在，證實(shí)輸注部位正確。③兩組繼續(xù)輸注LPN的同時，使用微量玻璃移液管(管尖周徑20～40 μm)在顯微鏡下進(jìn)行室旁核藥物注射，仍使用前囟和硬膜的背表面為基準(zhǔn)(計為零)，微量移液管進(jìn)行坐標(biāo)定位：尾側(cè)1.8～2.0 mm，外側(cè)0.5 mm，腹側(cè)7.4 mm。雙側(cè)室旁核應(yīng)用壓射系統(tǒng)進(jìn)行顯微注射NPYx(0.5 mmol/L，60 nL)或aCSF(配制：氯化鈉氯化鉀2.6 mmol/L、氯化鈣1.3 mmol/L、氯化鎂0.9 mmol/L、碳酸氫鈉20 mmol/L、磷酸氫二鈉1.3 mmol/L、葡萄糖2.0 mmol/L，pH為7.4)注射60 nL。注射10 min后(T2)，繪制壓力感受性反射曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后同樣應(yīng)用2.5%阿利新藍(lán)60 nL進(jìn)行注射，取組織制成冷凍切片。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)解剖圖譜確認(rèn)部位正確。

2 結(jié)果

2.1 兩組SNA、MAP、HR比較 見表1。

表1 兩組大鼠SNA、MAP、HR比較

注：與本組基礎(chǔ)時比較，*P<0.05；與本組T1時比較，△P<0.05；與PVN-aCSF組同期比較，#P<0.05。

2.2 兩組壓力反射功能參數(shù)SNA的Max、Min及BP50比較 見表2、圖1。

表2 兩組交感神經(jīng)壓力反射功能參數(shù)SNA的Max、Min及BP50比較

注：與本組基礎(chǔ)時比較，*P<0.05；與本組T1時比較，△P<0.05；與PVN-aCSF組同期比較，#P<0.05。

3 討論

糖尿病與高血壓的發(fā)病率逐年上升，二者相互影響[9]。LPN和NPY都與能量代謝、肥胖有關(guān)。有研究認(rèn)為，NPY可能與高血壓有關(guān)[10,11]，而且，LPN對高血壓和糖尿病均有影響[12]，因此推測，二者可能共同參與影響高血壓。SNA增加又是高血壓發(fā)病的重要機(jī)制之一[13]，所以它們可能對交感神經(jīng)均有影響，但具體通過何種途徑影響尚不清楚。本研究通過對2型糖尿病大鼠輸注LPN觀察SNA、HR、MAP等的變化，同時室旁核顯微注射NPY激動劑NPYx，觀察由LPN引起的交感神經(jīng)的變化是否受NPYx的影響，探討NPY在LPN調(diào)控SNA機(jī)制中的作用。

注：A為PVN-aCSF組；B為PVN-NPYx組。

圖1兩組SNA壓力感受性反射曲線圖

LPN由肥胖基因編碼，脂肪細(xì)胞分泌，是一種由67個氨基酸組成的、相對分子質(zhì)量約為16 kD的蛋白質(zhì)類激素[14]，它可以通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、損害孤束核壓力反射中樞而影響高血壓的發(fā)生、發(fā)展[15]；同時，它可通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)下行通路，抑制肝糖原異生，促進(jìn)骨骼肌對外周組織攝取和利用血糖，降低升血糖的激素，改善胰島素抵抗，從而降低血糖[16]。NPY是一種由交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元合成和分泌的含有36個氨基酸殘基的多肽，它具有比去甲腎上腺素更強(qiáng)更持久的縮血管作用，并能增強(qiáng)血管對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)，減弱血管對舒血管物質(zhì)的反應(yīng)，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[17]；研究[18]發(fā)現(xiàn)無論高血壓患者或是自發(fā)性高血壓大鼠，其血漿中NPY的水平均明顯升高。目前多個下丘腦核團(tuán)已被確定為靶點(diǎn)可誘導(dǎo)LPN啟動SNA增加，包括腹內(nèi)側(cè)下丘腦、弓狀核、背內(nèi)側(cè)核和下丘腦外側(cè)區(qū)，LPN也被證實(shí)在室旁核能使血壓增加[19]，但是否增加SNA及壓力感受性反射功能尚未觀察到。雖然LPN在許多腦區(qū)啟動交感興奮性效應(yīng)，但這些效應(yīng)均需與神經(jīng)介導(dǎo)的LPN受體結(jié)合并可能投射至室旁核后方起作用。另有報道認(rèn)為，室旁核可通過許多部位從而增加SNA，NPY受體亞型(Y1-R)在中樞系統(tǒng)廣泛表達(dá)，室旁核也可表達(dá)Y1-R[20,21]。有研究報道，2型糖尿病大鼠下丘腦神經(jīng)水平與LPN呈正相關(guān)性，LPN可與NPY神經(jīng)元上的LPN受體結(jié)合，抑制NPY分泌，二者形成LPN—下丘腦NPY軸，參與攝食，影響糖脂代謝[22]，這表明LPN可能參與調(diào)節(jié)下丘腦NPY水平，故本研究通過動物實(shí)驗(yàn)來探究NPY調(diào)節(jié)LPN對2型糖尿病大鼠SNA和壓力感受性反射功能的影響。本研究結(jié)果顯示：兩組在基礎(chǔ)及T1時輸注LPN后SNA、MAP、HR值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在PVN-aCSF組中，與基礎(chǔ)時相比,T1、T2時的SNA、MAP、HR值明顯升高，以T2時最高。在PVN-NPYx組中，與基礎(chǔ)時相比,T1、T2時SNA值明顯升高，以T1時最高。提示LPN可使2型糖尿病大鼠的SNA、MAP、HR值升高。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，PVN-NPYx組室旁核顯微注射NPYx后的SNA、MAP、HR值較同時間段的PVN-aCSF組明顯降低。說明室旁核注射NPYx后抑制了LPN對2型糖尿病大鼠的作用，由壓力反射曲線可知室旁核注射NPYx后的曲線與1 h輸注LPN后的曲線并未完全重合，推測NPY可能部分參與了LPN對2型糖尿病大鼠SNA的影響，且作用部位為下丘腦的室旁核。有研究報道，2型糖尿病大鼠下丘腦NPY與LPN受體水平呈負(fù)相關(guān)性[23]，故我們推測可能NPY激動劑使NPY的活性大大增加，食欲增加，通過LPN—下丘腦NPY軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，LPN分泌減少，同時LPN的受體水平下降，導(dǎo)致LPN無法與受體結(jié)合發(fā)揮作用，導(dǎo)致了LPN抵抗，進(jìn)而部分抑制了LPN對2型糖尿病大鼠SNA的作用。

壓力感受性反射功能對維持正常交感輸出具有關(guān)鍵作用，反射功能低下可導(dǎo)致交感活動反射性抑制功能缺乏，從而導(dǎo)致交感輸出的增加，即外周交感神經(jīng)活動亢進(jìn)[24]。高血壓患者的壓力反射感受功能均有一定程度的受損[25]。糖尿病早期已經(jīng)發(fā)生了自主神經(jīng)小纖維的神經(jīng)病變，由于慢性血糖升高導(dǎo)致的自主神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)受損，胰島素抵抗進(jìn)一步加重了自主神經(jīng)的損傷，導(dǎo)致糖尿病患者的壓力反射感受功能比正常人降低。有研究表明，LPN可作用于中樞，增加SNA，進(jìn)而降低壓力感受性反射功能[26]；亦有研究發(fā)現(xiàn)，隨著血壓分級的增高，2型糖尿病患者血清NPY水平逐漸增加，NPY水平升高可加重肥胖、胰島素抵抗，同時對糖尿病患者的自主神經(jīng)病變也有影響[27,28]。但NPY如何參與到LPN對2型糖尿病大鼠壓力感受性反射功能的影響中尚不清楚。本研究根據(jù)Boltzmann方程中的各數(shù)值關(guān)系，選擇交感神經(jīng)壓力反射功能參數(shù)Max、Min、BP50值的大小來反映壓力感受性反射功能的變化。本研究結(jié)果顯示，在PVN-aCSF組中，與基礎(chǔ)時相比,T1、T2時Max、Min、BP50值明顯升高；在PVN-NPYx組中，與基礎(chǔ)時相比,T1、T2時Max值明顯升高，PVN-NPYx組室旁核顯微NPYx后的Max、Min值較同時間段PVN-aCSF組大鼠明顯降低。表明NPY減弱了LPN增強(qiáng)2型糖尿病大鼠的壓力感受性反射功能的作用。結(jié)合壓力感受性反射曲線，1 h輸注LPN后、室旁核顯微注射NPYx后Max、Min、BP50值較基礎(chǔ)時升高，但未降至基礎(chǔ)時水平，進(jìn)一步證實(shí)了NPY可能部分參與調(diào)控了LPN影響交感神經(jīng)系統(tǒng)的途徑。

綜上所述，NPY雙側(cè)室旁核顯微注射可逆轉(zhuǎn)LPN增加2型糖尿病大鼠SNA的作用，減弱LPN增強(qiáng)2型糖尿病大鼠壓力感受性反射功能的作用。