響應(yīng)面法優(yōu)化超高壓處理提取金銀花綠原酸工藝

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(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東濟南 250000;2.山東上水農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司,山東淄博 255000)

金銀花(又名雙花、忍冬花等)為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb)的干燥花蕾或初開的花,味甘、性涼,主肺、心、胃經(jīng),具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱的功效,可用于治療癰腫疔瘡、咽喉麻痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱傷風(fēng)、溫?zé)嵬藷?藥用歷史悠久,有“中藥抗生素”之稱[1-2]。山東金銀花產(chǎn)量居全國首位,對金銀花進行深加工,豐富金銀花產(chǎn)品種類,提高產(chǎn)品的附加值,可以帶動當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展。

綠原酸是金銀花的主要藥用成分[3],具有清熱解毒和抗菌消炎作用[4],對消化道癌癥具有明顯的抑制作用,與人體血小板凝集和凝血因子的生成有關(guān),還具有抗生育作用及對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[5-6]。從金銀花中提取綠原酸多采用水提法、醇提法、微波提取法、超聲提取法等方法[8-9]。超高壓提取技術(shù)是利用以上的流體靜壓力作用于溶劑和植物物料的混合液,保壓幾分鐘后卸壓,隨后進行分離純化,從而達到提取的目的。超高壓提取技術(shù)具有提取得率高、耗時短、能耗低、提取液澄清、雜質(zhì)含量少、常溫下操作,保護熱不穩(wěn)定成分的活性、操作簡單等優(yōu)勢。研究表明,超高壓提取法同超聲提取法、熱回流提取法進行比較,超高壓提取效果明顯優(yōu)于超聲提取和熱回流提取。本實驗以金銀花為原料,采用超高壓處理金銀花,研究壓力、保壓時間、提取時間等因素對金銀花綠原酸得率的影響,提高金銀花綠原酸的得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 山東上水農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;蒸餾水、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯 均為分析純,濟南市三新俐華公司;綠原酸標準品 北京索萊寶科技有限公司。

QJ32W1000A型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;AB135-S型電子分析天平 METTLER TOLEDO公司;RE111型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BBCHI公司;SHB-Ш循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;HPP/0.6L超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物技術(shù)有限公司;XMTD-8222型真空干燥箱 濟南龍瑞商貿(mào)有限公司;索氏抽提器 實驗室組裝。

圖1 超高壓設(shè)備及其結(jié)構(gòu)圖Fig.1 UHV equipment and its structure

1.2 實驗方法

1.2.1 超高壓處理金銀花 將金銀花鮮花在真空干燥箱(90 ℃,12 h)中干燥,用粉碎機粉碎為粉末。取適量的金銀花粉末置于真空包裝袋中真空密封,再將真空袋置于超高壓設(shè)備中,設(shè)置壓力和保壓時間進行超高壓處理。

1.2.2 金銀花綠原酸的提取

1.2.2.1 綠原酸提取的工藝流程 金銀花粉碎→索氏抽提→抽濾→濃縮→冷沉離心→真空冷凍干燥

1.2.2.2 操作步驟 稱取經(jīng)超高壓處理的金銀花粉末200.0 g,加入一定體積的一定濃度的乙醇浸泡12 h,用索氏提取器提取一定時間后,用真空抽濾裝置進行抽濾,將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(40 ℃)減壓濃縮。將濃縮液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,加入適量的石油醚脫色處理2次,再用適量的乙酸乙酯萃取4次[7],以上步驟均取下層液體。將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,得到的濃縮液冷沉離心(4000 r/min,5 min),將下層沉淀真空冷凍干燥(30 ℃,24 h)得到金銀花綠原酸提取物。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取壓力對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取金銀花粉末各200 g,置于真空袋中,設(shè)置壓力為100、200、300、400、500 MPa,保壓時間為10 min,超高壓處理完后,固定提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%(乙醇與水的比例為6∶4,下文同),提取得到綠原酸。

1.2.3.2 保壓時間對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取金銀花粉末各200 g,置于真空袋中,設(shè)置保壓時間為5、7.5、10、12.5、15 min,壓力為300 MPa,超高壓處理完后,固定提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%,提取得到綠原酸。

1.2.3.3 提取時間對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取金銀花粉末各200 g,置于真空袋中,設(shè)置壓力300 MPa,保壓時間10 min,超高壓處理完后,固定料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%,分別對金銀花粉末進行提取1、1.5、2、2.5、3 h,得到綠原酸。

常壓下,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%的條件下,分別對金銀花粉末進行提取1、1.5、2、2.5、3 h,得到綠原酸。

1.2.3.4 液料比對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取200 g金銀花粉末,置于真空袋中,設(shè)置壓力300 MPa,保壓時間10 min,固定提取時間2 h,乙醇濃度60%,分別在料液比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15 g/mL的條件下提取得到綠原酸。

常壓下,固定提取時間2 h,乙醇濃度60%,分別在液料比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12、1∶15 g/mL的條件下提取得到綠原酸。

1.2.3.5 乙醇濃度對金銀花綠原酸得率的影響 分別稱取200 g金銀花粉末,置于真空袋中,設(shè)置壓力300 MPa,保壓時間10 min,提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,分別用乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇對金銀花粉末進行提取,得到綠原酸。

常壓下,固定提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,分別用乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇對金銀花粉末進行提取,得到綠原酸。

實驗重復(fù)三次取平均值。

1.2.4 超高壓提取金銀花綠原酸的響應(yīng)面工藝優(yōu)化 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,以提取壓力、保壓時間、提取時間、液料比和乙醇濃度為考察變量,采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案,采用五因素三水平對工藝條件進行優(yōu)化[10]。

1.2.5 金銀花綠原酸含量的測定

1.2.5.1 標準曲線的繪制 稱取綠原酸標準品10 mg,用無水乙醇溶解,定容至100 mL,分別取0、1、2、3、4、5、6 mL于7個25 mL容量瓶中,用無水乙醇定容。分別用分光光度計在330 nm處測吸光度。并以吸光度為縱坐標,綠原酸標準品質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線[8-9]。

1.2.5.2 金銀花綠原酸含量的測定 稱取提取的綠原酸樣品1 mg,用適量無水乙醇溶解,定容至25 mL,搖勻靜置。用分光光度計在330 nm處測吸光值,計算綠原酸的含量及得率。

綠原酸得率(%)=根據(jù)標準曲線測得的含量/原金銀花質(zhì)量×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8 Pro SR4軟件和Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取壓力對金銀花綠原酸得率的影響 從圖2可以看出,隨著提取壓力的增加,金銀花綠原酸的得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在提取壓力為300 MPa時,得率達到最大值。這是由于金銀花細胞在超高壓條件下,細胞內(nèi)外的巨大壓力差會破壞細胞結(jié)構(gòu),提高有效成分的滲透速率和溶劑的擴散動力,從而使金銀花綠原酸得率提高。但當壓力超過300 MPa時,由于壓力差過大,促使金銀花細胞中的其他大分子物質(zhì)滲透出(如蛋白質(zhì)、色素等)造成溶質(zhì)通道的堵塞,影響了金銀花的提取效果,降低了金銀花綠原酸的得率。因此,最適提取壓力選擇為300 MPa。

圖2 提取壓力對金銀花綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.2 保壓時間對金銀花綠原酸得率的影響 從圖3可以看出,保壓時間在5～10 min時,金銀花綠原酸的得率隨著保壓時間的增加而升高;當保壓時間超過10 min后,得率基本保持不變。這是由于在巨大的壓力下,金銀花細胞內(nèi)的有效成分的滲透速率和溶劑的傳質(zhì)速率迅速增加,當達到平衡后,滲透速率和傳質(zhì)速率不再增加,所以繼續(xù)增加保壓時間,金銀花綠原酸的得率基本保持不變。因此,最適保壓時間選擇為10 min。

圖3 保壓時間對金銀花綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of holding time on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.3 提取時間對金銀花綠原酸得率的影響 從圖4可以看出,提取時間在1～2 h時,金銀花綠原酸的得率隨著保壓時間的增加而升高;當提取時間超過2 h時,得率基本保持不變。這是由于在提取開始時,隨著時間的增加,金銀花中的有效成分不斷擴散到溶劑中,當擴散達到平衡時,有效成分不再擴散,得率基本保持不變。所以繼續(xù)增加提取時間,金銀花綠原酸的得率基本保持不變。因此,最適提取時間選擇為2 h。

2.1.4 液料比對金銀花綠原酸得率的影響 從圖5可以看出,在加壓條件下,金銀花綠原酸的得率在料液比1∶5～1∶10 g/mL時,隨著料液比的增加而增大,料液比超過1∶10 g/mL時,綠原酸的得率基本保持不變。在常壓條件下,金銀花綠原酸的得率隨著料液比的增加而提高,但加壓條件下的提取率明顯高于常壓條件下的提取率。這是因為,隨著料液比的增加,金銀花細胞內(nèi)有效成分的擴散速率不斷增加,到料液比增大到一定量時,綠原酸擴散速率達到平衡,不再增加,繼續(xù)增大料液比,傳質(zhì)動力不再增加,綠原酸的得率不再增大,且會造成提取溶劑的浪費。因此,選擇1∶10 g/mL為最適料液比。

圖5 料液比對金銀花綠原酸得率的影響Fig.5 Effect of ratio of material to liquid on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

2.1.5 乙醇濃度對金銀花綠原酸得率的影響 從圖6可以看出,在加壓條件下,在乙醇濃度小于60%時,金銀花綠原酸的得率隨著乙醇濃度的增加而增大,在乙醇濃度為60%時達到最大值,當乙醇濃度大于60%時,金銀花綠原酸的提取率呈下降趨勢。這是由于當乙醇濃度較大時,一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的物質(zhì)溶出量增加,這些成分與綠原酸競爭乙醇,從而導(dǎo)原綠原酸的得率降低。因此,選擇60%為最適乙醇濃度。

圖6 乙醇濃度對金銀花綠原酸得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on the yield of honeysuckle chlorogenic acid

由圖4～圖6可以明顯看出,加壓條件下金銀花綠原酸的得率明顯高于常壓下的得率,因此提取時需在加壓條件下進行。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

以金銀花綠原酸提取率為響應(yīng)值,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取對綠原酸得率有明顯影響的壓力、保壓時間、提取時間、料液比、乙醇濃度進行五因素三水平的響應(yīng)面分析實驗。

表2 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken center combination test

將實驗數(shù)據(jù)用Design Expert軟件進行多元回歸擬合,得到以提取率為目標函數(shù)的回歸方程:

Y=4.87+0.38A+0.28B+0.17C+0.11D+0.18E+0.22AB+0.13AC+0.11AD+0.073AE+0.12BC+0.033BD-0.19BE+0.042CD+0.048CE+0.070DE-0.59A2-0.47B2-0.47C2-0.37D2-0.25E2

表3 精油提取率響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of essential oil extraction rate response surface regression model

根據(jù)回歸方程作出相應(yīng)等高線及其曲面圖(見圖7),列出的圖為對綠原酸得率影響顯著的因素的交互作用圖,考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀,分析各因素對綠原酸得率的影響。由圖7可知,壓力與保壓時間交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖中,曲線較陡,說明提取壓力與保壓時間交互作用顯著,而保壓時間與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖曲線相對平緩,對綠原酸得率影響的顯著性次之,且圖中的等高線均為橢圓形,表明其交互作用顯著,這與回歸方程的各項方差分析結(jié)果一致[11-13]。

圖7 各因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface map and contour map of interaction of various factors

2.3 最佳配方與模型驗證

根據(jù)三維響應(yīng)圖可以看出,利用Design-Expert軟件對配方進行優(yōu)化,得到金銀花綠原酸的最佳提取條件為:提取壓力324.018 MPa,保壓時間10.573 min,提取時間2.082 h,料液比10.440 mg/L,乙醇濃度61.822%,得率預(yù)測值為5.090%。校正后最佳條件為:提取壓力325 MPa,保壓時間10 min,提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%。根據(jù)此條件,驗證回歸模型的有效性,3次驗證實驗表明,實測得率平均值為4.872%±0.049%,與預(yù)測理論值僅相差0.43%,說明該模型的擬合程度較好,此回歸方程能較好的預(yù)測綜合評分,具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

各因素對金銀花綠原酸得率影響的次序為:提取壓力>保壓時間>乙醇濃度>提取時間>料液比。金銀花綠原酸提取的最佳條件為:壓力325 MPa,保壓時間10 min,提取時間2 h,料液比1∶10 g/mL,乙醇濃度60%。在此條件下,綠原酸得率為4.872%±0.049%。實驗證明,超高壓處理能夠提高綠原酸的得率。