解肝磷脂土地桿菌(Pedobacter heparinus)源唾液酸醛縮酶基因的異源表達(dá)及其活性研究

, ,, ,Josef Voglmeir

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,糖組學(xué)與糖生物工程實(shí)驗室,江蘇南京 210095)

唾液酸是一類含九個碳原子的羧基化單糖?；苌锏目偡Q[1],通常位于糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂及多糖胺等寡糖鏈末端,其主要形式包括游離的唾液酸、唾液酸衍生物及聚唾液酸[2]。唾液酸作為重要的生物信息傳遞分子在生物體內(nèi)有著十分重要的生物學(xué)功能[3]。

唾液酸醛縮酶又稱N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶[4],是唾液酸及其類似物代謝途徑中的關(guān)鍵酶,能催化N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)的可逆羥醛加成反應(yīng),調(diào)控唾液酸的合成[5]。唾液酸醛縮酶酶多發(fā)現(xiàn)于微生物體內(nèi),例如大腸桿菌(E.coli)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)、假單胞菌(Pseudomnoas)、變形桿菌(Proteus)及微球菌(Micrococcus)等[6]。目前已發(fā)掘了E.coli源及流感嗜血桿菌源唾液酸醛縮酶,但市面上可購買的唾液酸醛縮酶種類仍然有限,同時價格較高,因此有必要開發(fā)新的來源的唾液酸醛縮酶。解肝磷脂土地桿菌(Pedobacterheparinus)是一種從土壤中分離得到的革蘭氏陰性好氧菌[7],其全基因組信息已經(jīng)公布,但關(guān)于Pedobacterheparinus源的唾液酸醛縮酶至今未見相關(guān)報道。由于唾液酸醛縮酶在該野生型菌株中為誘導(dǎo)酶,即通常生理狀態(tài)下不進(jìn)行表達(dá)或者酶量較低,只有以價格昂貴的唾液酸作為誘導(dǎo)劑時才能進(jìn)行大量表達(dá)[8],因此實(shí)現(xiàn)該酶的大量異源重組表達(dá)是大量獲得該酶的必要途徑。

目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白酶異源表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[9]。在該系統(tǒng)中,啟動子是決定基因表達(dá)水平的關(guān)鍵因素之一,對目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控等極為重要[10]。啟動子是一段能夠識別RNA聚合酶的DNA序列,通過指導(dǎo)模板同全酶結(jié)合,來啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄[11]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中能發(fā)揮作用的啟動子種類較多,根據(jù)其調(diào)控方式的不同可分為誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子[12]。其中,誘導(dǎo)型啟動子需添加誘導(dǎo)劑才能夠調(diào)控目的基因的表達(dá),如T7·lac啟動子需以乳糖類似物作為誘導(dǎo)劑,該類型啟動子的優(yōu)點(diǎn)是能夠掌握酶的表達(dá)時間和水平[13]。最近的研究報道中,已有不少學(xué)者選用組成型啟動子來調(diào)控外源基因的表達(dá),該類型的啟動子能夠在細(xì)胞開始生長時就自主表達(dá)異源蛋白酶,無需添加誘導(dǎo)劑,具有調(diào)控方式更為簡便、操作成本低等優(yōu)點(diǎn)[14]。

針對大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中兩種啟動子各有優(yōu)勢的特點(diǎn),本研究先以大腸桿菌表達(dá)載體pRSFDuet-1為骨架,設(shè)計插入組成型啟動子,合成組成型表達(dá)載體。再以細(xì)菌屬Pedobacterheparinus作為目標(biāo)菌株,將其擬編碼唾液酸醛縮酶的基因PhNeuLy3300進(jìn)行擴(kuò)增,并構(gòu)建至上述含組成型啟動子的表達(dá)載體及含誘導(dǎo)型啟動子的商業(yè)表達(dá)載體pET-30a,分別以誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子對Pedobacterheparinus源唾液酸醛縮酶進(jìn)行體外異源表達(dá),旨在以較為經(jīng)濟(jì)、簡易的表達(dá)條件得到重組唾液酸醛縮酶。其中,將含誘導(dǎo)型啟動子的pET-30a商業(yè)載體表達(dá)所得的唾液酸醛縮酶進(jìn)一步純化及活性測定,以期得到能運(yùn)用于后續(xù)體外酶學(xué)特性研究的純酶,通過對組成型表達(dá)載體表達(dá)所得的粗酶進(jìn)行酶活驗證,為唾液酸醛縮酶在大腸桿菌體內(nèi)合成唾液酸的應(yīng)用奠定基礎(chǔ),同時也為重組蛋白的表達(dá)提供一種新型、高效、方便的表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株P(guān)edobacterheparinus(DSM 2366) 德國(DSMZ)微生物與細(xì)胞保藏中心;基因克隆菌株Top10(經(jīng)抗噬菌體改后造命名為BMMach1 T1)和大腸桿菌表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3) 北京天根生化科技有限公司;pGH-T克隆載體 上海捷瑞公司;pET-30a和pRSFDuet-1表達(dá)載體 Novagen公司;組成型調(diào)控基因序列EM5和PCR擴(kuò)增引物 由本實(shí)驗室設(shè)計后交南京金斯瑞(genescript)公司合成;rTaq DNA聚合酶 Takara公司;T4 DNA連接酶、去磷酸化酶FastAP以及限制性核酸內(nèi)切酶Nde I、Xho I Thermo Scientific公司;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 北京索萊寶科技有限公司;卡那霉素(50 μg/mL)和氨芐青霉素(100 μg/mL) 南京壽德生物科技有限公司;AxyPrep DNA回收試劑盒和AxyPrep 質(zhì)粒提取試劑盒 Axygen公司;基因測序 南京金斯瑞(genescript)公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 原核表達(dá)載體pRSF-EM5的設(shè)計合成 首先利用SnapGene軟件分析具有不同抗性基因標(biāo)簽的表達(dá)載體圖譜,獲取各類抗性基因(殺稻瘟菌素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素及潮霉素等)的調(diào)控序列,根據(jù)Neutral networkpromoter prediction及Vector NTI(V10.0)等軟件工具的分析,認(rèn)為可以其為組成型啟動子設(shè)計組成型基因調(diào)控序列(EM5)模塊。該模塊由5組酶切位點(diǎn)(Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I及Bgl II/Avr II)與各啟動子相互串聯(lián)形成相對獨(dú)立的表達(dá)盒,并在序列最前面引入Nco I酶切位點(diǎn)。設(shè)計的EM5序列交由南京金斯瑞公司合成,再經(jīng)Nco I、Avr II雙酶切后,連接至商業(yè)載體pRSFDuet-1,即定向改造得到新的組成型原核表達(dá)載體pRSF-EM5。

1.2.2 綠色熒光蛋白在pRSF-EM5載體中的表達(dá) 為檢測改造后的載體pRSF-EM5能否由組成型啟動子啟動并完成異源蛋白的自主表達(dá),將編碼綠色熒光蛋白的基因(GFP)兩端分別添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I、Bgl II/Avr II,經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增后,分別連接至pRSF-EM5載體,再將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(BMMach1 T1細(xì)胞)中,利用PCR法篩選重組轉(zhuǎn)化子,最后利用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性菌落質(zhì)粒并導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)細(xì)胞。其中PCR反應(yīng)體系如表1所示,PCR各引物序列如表2所示,PCR程序設(shè)置為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,循環(huán) 35 次,72 ℃ 10 min。挑取適量含重組GFP基因的E.coliBL21(DE3)菌株于5 mL LB培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)表達(dá)20 h。待表達(dá)完成后,12000 r/min離心收集菌體,于藍(lán)光板上觀察菌體顏色。

表2 綠色熒光蛋白基因PCR引物序列Table 2 Primers for PCR amplification of GFP genes

表1 綠色熒光蛋白基因PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR amplification reaction system of GFP genes

1.2.3Pedobacterheparinus唾液酸醛縮酶基因擴(kuò)增 通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫比對,從Pedobacterheparinus基因組中篩選到疑似編碼唾液酸醛縮酶的基因序列,命名為PhNeuLy3300。利用軟件Primer Premier5設(shè)計其PCR擴(kuò)增引物,并在引物的5′端分別引入Nde I、Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。前引物F:5′-CATATGATGACGATGCAAAAATT AGAA-3′,后引物R:5′-CTCGAGTTATTGTGAAGTG CTGACGC-3′。PCR反應(yīng)體系如表3所示,其具體擴(kuò)增程序為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,循環(huán)35次,72 ℃ 10 min。Pedobacterheparinus基因組DNA根據(jù)Mahuku[15]等報道的方法進(jìn)行提取。以基因組DNA為模板進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增所得產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析,并利用Axygen DNA 回收試劑盒進(jìn)行切膠回收。

表3 唾液酸醛縮酶基因PCR反應(yīng)體系Table 3 PCR amplification reaction system of PhNeuly3300

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 回收的DNA片段經(jīng)T4 DNA連接酶作用,連接至pGH-T克隆載體上,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BMMach1 T1細(xì)胞中,使用藍(lán)白斑法篩選重組轉(zhuǎn)化子[16],并挑取白色單菌落以M13通用引物進(jìn)行PCR法鑒定。利用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒對陽性菌落進(jìn)行質(zhì)粒抽提,得到的質(zhì)粒經(jīng)Nde I、Xho I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,酶切后的DNA片段在T4 DNA連接酶的作用下,分別連至經(jīng)相同酶切處理的pET-30a和pRSF-EM5表達(dá)載體上。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BMMach1 T1細(xì)胞中,并利用PCR法篩選重組轉(zhuǎn)化子,得到的陽性菌落分別送至公司進(jìn)行測序,得到構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET-30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300。

1.2.5 唾液酸醛縮酶的異源表達(dá)和純化 提取重組質(zhì)粒pET-30a-PhNeuLy3300和pRSF-EM5-PhNeuLy3300,轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)。分別挑取單菌落于5 mL含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),然后接種至400 mL LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。其中含重組質(zhì)粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的菌液于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)表達(dá)20 h,含重組質(zhì)粒pET-30a-PhNeuLy3300的菌液于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)直至菌液濃度達(dá)到OD600為0.5～0.7,加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L,轉(zhuǎn)18 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)20 h。

4 ℃、4000 r/min離心收集菌體,利用10 mL細(xì)胞裂解液(100 mmol/L氯化鈉,1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))將菌體沉淀重懸。將含重組質(zhì)粒pET-30a-PhNeuLy3300的裂解液經(jīng)超聲進(jìn)行細(xì)胞破碎,4 ℃、12000 r/min離心收集上清,再利用鎳親和層析柱(Ni-NTA)進(jìn)行純化。純化柱經(jīng)5倍柱體積的平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L氯化鈉,pH8.0)平衡后上樣,再由10倍柱體積的結(jié)合緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L咪唑,50 mmol/L氯化鈉,pH8.0)沖洗去除非特異性結(jié)合的蛋白,最后用10 mL體積的洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L氯化鈉,500 mmol/L咪唑,pH8.0)洗脫目標(biāo)蛋白,280 nm波長檢測洗脫液,收集重組蛋白酶。

將重組蛋白pRSF-EM5-PhNeuLy3300細(xì)胞裂解液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),以不含目的重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)細(xì)胞裂解液為對照,分析重組蛋白的表達(dá)水平。另取pET-30a-PhNeuLy3300誘導(dǎo)前后、上清和純化后樣品進(jìn)行SDS-PAGE,以分析不同載體中重組酶的表達(dá)水平及純化情況。其中,分離膠電泳電壓均為100 V,濃縮膠電泳電壓均為80 V。并使用Bradford法的蛋白定量試劑盒,以牛血清蛋白(BSA)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定純化后的pET-30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶濃度,具體操作按說明書進(jìn)行。

1996年，Worden和Smalley[16]通過研究碳酸鹽油氣藏中生成H 2 S的化學(xué)反應(yīng)，并結(jié)合標(biāo)志元素硫、碳的同位素數(shù)據(jù)，烴類與CaSO4的反應(yīng)方程見式(7)～式(9):

1.2.6 唾液酸醛縮酶的活性測定 重組唾液酸醛縮酶的活性通過酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。以N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac,400 μmol/L)為底物,與輔酶 I(NAD+,2 mmol/L)、磷酸鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L,pH6.5)、N-乙酰甘露糖胺脫氫酶(ManNAc Dehydrogenase,10 mU)混合后加入384孔酶標(biāo)板,最后分別加入純化后的pET-30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶(純酶,25 μL)和pRSF-EM5-PhNeuLy3300 細(xì)胞裂解液(粗酶,25 μL),立即放入酶標(biāo)儀內(nèi),在340 nm波長處進(jìn)行實(shí)時檢測(每20 s讀數(shù)1次(s),共讀數(shù)700次,溫度37 ℃)。以不含Neu5Ac或不含目的重組蛋白酶的組分為陰性對照,其中不含底物的體系以等體積去離子水替代Neu5Ac,其余組分均保持不變,不含目的重組蛋白酶的體系以等體積大腸桿菌細(xì)胞裂解上清液(原菌株不含表達(dá)目的重組蛋白酶的質(zhì)粒)替代,其余組分均保持不變。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗中蛋白酶濃度的測定及重組酶活測定每組重復(fù)三次,采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與曲線圖的繪制,應(yīng)用Adobe Illustrator CS5軟件輔助作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的改造

商業(yè)載體pRSFDuet-1為大腸桿菌蛋白雙基因表達(dá)載體,含兩個多克隆位點(diǎn),即該載體由兩個T7·lac啟動子起始轉(zhuǎn)錄,因此在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中需添加IPTG作為誘導(dǎo)劑才能表達(dá)異源目標(biāo)蛋白[17]。為使pRSFDuet-1載體免受誘導(dǎo)劑影響,自主表達(dá)外源蛋白,本實(shí)驗設(shè)計了組成型調(diào)控序列EM5模塊。如圖1所示,該模塊由表達(dá)抗性基因殺稻瘟菌素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素及潮霉素的調(diào)控序列和5組克隆位點(diǎn)相互串聯(lián)組成,并于各組克隆位點(diǎn)前引入ATG堿基,序列總長為544 bp。其中抗性基因的調(diào)控序列能夠作為組成型啟動子自主啟動插入的目的基因的表達(dá),5組酶切位點(diǎn)Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I及Bgl II/Avr II可作為多克隆位點(diǎn)同時插入5種目標(biāo)蛋白基因,為多基因共表達(dá)的實(shí)現(xiàn)提供基礎(chǔ)。

圖1 組成型調(diào)控序列EM5的設(shè)計Fig.1 Design of constitutive regulatory gene sequence EM5

EM5模塊與pRSFDuet-1載體的整合位點(diǎn)如圖2所示,組成型調(diào)控序列(EM5,B)替換了原載體上的多克隆位點(diǎn)序列(MCS1-MCS2,A),并保留了原載體上第一個T7·lac啟動子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome Binding site,RBS)。根據(jù)設(shè)計,改造后的pRSF-EM5載體理論上可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中同時自主表達(dá)5種目的蛋白,不需添加誘導(dǎo)劑。

圖2 商業(yè)載體pRSFDuet-1與組成型調(diào)控序列的整合Fig.2 Integration of pRSFDuet-1 vector and constitutive regulatory gene sequence注:A:商業(yè)載體pRSF-Duet1圖譜;MCS:多克隆位點(diǎn);B:組成型表達(dá)載體圖譜。

2.2 綠色熒光蛋白的表達(dá)

鑒于編碼綠色熒光蛋白基因序列較短,構(gòu)建載體方便[18],因此可將綠色熒光蛋白基因克隆至pRSF-EM5載體中,檢測改造后的組成型載體是否能夠自主表達(dá)綠色熒光蛋白,以驗證改造后的新載體的功能。

由于EM5的序列設(shè)計有5組可用于插入目的基因,因此本研究將綠色熒光蛋白基因分別構(gòu)建至pRSF-EM5載體上Nde I/Xho I、EcoR I/Pme I、Kpn I/Spe I、Sac I/Mfe I、Bgl II/Avr II等5個克隆位點(diǎn)進(jìn)行重組表達(dá)。重組綠色熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖3所示:5組含重組綠色熒光蛋白質(zhì)粒的菌體沉淀均能在藍(lán)光下發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光,而不含該重組綠色熒光蛋白質(zhì)粒的菌體則無明顯可見光,證明設(shè)計合成的組成型啟動子能被大腸桿菌宿主識別,改造后的載體pRSF-EM5能夠在無誘導(dǎo)劑存在的條件下,自主表達(dá)插入的外源目的蛋白,從而證明組成型啟動子的表達(dá)載體構(gòu)建成功,且每一個克隆位點(diǎn)都具有正常功能,可以單獨(dú)用于外源基因的插入和表達(dá)。除此以外,該載體可以同時承載多個能夠自主啟動表達(dá)的克隆位點(diǎn),因此可用于進(jìn)行多個基因共表達(dá)的嘗試。

圖3 重組載體上綠色熒光蛋白自主表達(dá)Fig.3 Constitutive expression of GFP with constructed recombinant vector

2.3 目的基因克隆及序列比對

利用生物信息學(xué)同源比對的方法,從Pedobacterheparinus(DSM2366)基因組中找到疑似編碼唾液酸醛縮酶的基因,并命名為PhNeuLy3300,基因為全長945 bp。通過PCR擴(kuò)增獲得了該完整基因,雙酶切后分別與含誘導(dǎo)型啟動子的pET-30a及含組成型啟動子的pRSF-EM5表達(dá)載體連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒,對質(zhì)粒進(jìn)行目標(biāo)基因序列的PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳驗證了插入基因片段的大小,如圖4所示,pET30a-PhNeuLy3300及pRSF-EM5-PhNeuLy3300的DNA片段均為單一條帶且與預(yù)期的理論基因大小一致,證明插入片段正確。

圖4 PhNeuLy3300基因PCR結(jié)果Fig.4 PCR result of PhNeuLy3300 genes注:M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(bp),1:pET30a-PhNeuLy3300基因,2:pRSF-EM5-PhNeuLy3300基因。

測序結(jié)果表明克隆得到的重組pET30a-PhNeuLy3300基因及重組pRSF-EM5-PhNeuLy3300基因均與Pedobacterheparinus基因序列匹配。如圖5、圖6所示,完整開放閱讀框全長945 bp,共編碼314個氨基酸殘基,且pET30a-PhNeuLy3300帶有C-端組氨酸標(biāo)簽,而pRSF-EM5載體不帶組氨酸標(biāo)簽,也即pRSF-EM5-PhNeuLy3300無C-端組氨酸標(biāo)簽。兩組測定序列與GeneBank公布的相應(yīng)序列同源性均為100%,證明插入片段即為目的基因片段,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 pET30a-PhNeuLy3300酶基因的測序比對結(jié)果Fig.5 Comparison result of pET30a-PhNeuLy3300 genes

圖6 pRSF-EM5-PhNeuLy3300酶基因的測序比對結(jié)果Fig.6 Comparison result of pRSF-EM5-PhNeuLy3300 genes

2.4 重組蛋白的表達(dá)和純化

含重組質(zhì)粒pET30a-PhNeuLy3300的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前后菌體、裂解所得上清液和鎳親和層析柱純化組分的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖8(A)所示。通過比較IPTG誘導(dǎo)前后菌體的蛋白樣品,可見誘導(dǎo)后菌體在分子量30～40 kDa左右具有一明顯增強(qiáng)條帶,且裂解上清液和純化后的樣品在相同位置都具有信號,應(yīng)為所表達(dá)重組蛋白PhNeuLy3300,其表觀分子量與理論分子量36.4 kDa相符合,表明重組質(zhì)粒pET30a-PhNeuLy3300可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá),經(jīng)鎳柱純化可得到純度較高的重組蛋白。由改良型Bradford試劑盒測定,所得蛋白濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示,根據(jù)相同條件下待測蛋白樣品的吸光值以及樣品稀釋倍數(shù),計算出pET30a-PhNeuLy3300重組蛋白濃度為3.29 mg/mL。

圖7 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of protein concentration注:BSA:牛血清蛋白

圖8 PhNeuly3300酶SDS-PAGE電泳圖Fig.8 SDS-PAGE electrophoresis of recombined PhNeuLy3300注:(A)pET30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa);1:IPTG誘導(dǎo)前菌體;2:IPTG誘導(dǎo)后菌體;3:細(xì)胞裂解液上清;4:鎳親和層析柱純化后蛋白。(B)pRSF-EM5-PhNeuLy3300重組蛋白酶SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa);1:細(xì)胞裂解液上清(原菌株不含pRSF-EM5-PhNeuLy3300質(zhì)粒);2:細(xì)胞裂解液上清(原菌株含pRSF-EM5-PhNeuLy3300質(zhì)粒)。

含重組質(zhì)粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的大腸桿菌在無誘導(dǎo)劑添加的條件下進(jìn)行培養(yǎng),裂解菌體所得上清液的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖8(B)所示。通過與不含目的重組質(zhì)粒的大腸桿菌上清液進(jìn)行比較,可見含重組質(zhì)粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300的菌體在分子量30～40 kDa左右具有一增加的蛋白條帶,且表觀分子量與目的蛋白理論分子量36.4 kDa相吻合,即為所表達(dá)的重組蛋白PhNeuLy3300,表明重組質(zhì)粒pRSF-EM5-PhNeuLy3300可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)組成型啟動子作用進(jìn)行自主表達(dá)。

2.5 重組唾液酸醛縮酶的活性研究

唾液酸醛縮酶可以催化可逆的唾液酸裂解生成N-乙酰-甘露糖胺與丙酮酸的反應(yīng),故可利用從Neu5Ac轉(zhuǎn)化為N-乙酰-甘露糖胺的酶促反應(yīng)檢測PhNeuLy3300酶的活性。N-乙酰-甘露糖胺的檢測則由N-乙酰-甘露糖胺脫氫酶完成。N-乙酰-甘露糖胺脫氫酶能將N-乙酰-甘露糖胺氧化,同時將NAD+還原成NADH,NADH在紫外340 nm下可檢測吸光值。故可通過酶標(biāo)儀驗證是否有NADH生成從而間接檢測重組PhNeuLy3300酶是否有活性。

活性檢測結(jié)果如圖9所示,pRSF-EM5-PhNeuLy3300粗酶(細(xì)胞裂解液)催化底物Neu5Ac的反應(yīng)(組1),1 h內(nèi)340 nm處吸光值快速增加且達(dá)到最大值;當(dāng)pET30a-PhNeuLy3300純酶與底物Neu5Ac同時存在時(組2),340 nm處吸光值明顯升高,但反應(yīng)速率相對緩慢,3 h后340 nm處的吸光值達(dá)到最大;而反應(yīng)中不含底物NeuAc(組3),或不含重組PhNeuLy3300酶時(組4),340 nm處吸光值沒有增加;表明N-乙酰-甘露糖胺脫氫酶不能以Neu5Ac為底物進(jìn)行反應(yīng),可判斷經(jīng)誘導(dǎo)型和組成型啟動子表達(dá)所得的唾液酸醛縮酶PhNeuLy3300均具有較好的活性。

圖9 重組PhNeuly3300酶活性檢測圖Fig.9 Enzyme activity detection of PhNeuLy3300注:組1:pRSF-EM5-PhNeuLy3300重組蛋白酶的活性檢測;組2:pET30a-PhNeuLy3300重組蛋白酶的活性檢測;組3:不含底物Neu5Ac的活性檢測反應(yīng);組4:不含PhNeuLy3300目的重組酶的活性檢測反應(yīng)。

3 討論

發(fā)掘新型唾液酸醛縮酶、構(gòu)建其工程菌,可有效提高唾液酸醛縮酶的異源表達(dá)量,免去其在野生型菌株中表達(dá)所必需的誘導(dǎo)劑N-乙酰神經(jīng)氨酸,解決在應(yīng)用研究中市售商品酶來源稀缺等問題。在過去的二十年里,成千上萬的微生物基因組序列已被測出。對這些基因數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析,利用基因工程技術(shù)克隆并構(gòu)建重組蛋白酶表達(dá)體系,是得到新型唾液酸醛縮酶最簡單高效的途徑[19]。

本論文利用NCBI等相關(guān)網(wǎng)站和軟件,對一些酶的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,在基因序列比對的基礎(chǔ)上,從來自土壤中的Pedobacterheparinus細(xì)菌中獲得了唾液酸醛縮酶基因片段。據(jù)相關(guān)資料顯示,Pedobacterheparinus俗稱肝素黃桿菌[20],一般生長于土壤中,該菌種最適生長環(huán)境溫度為25～30 ℃[21],其作為唾液酸醛縮酶基因的供體菌極易獲得。此外,文獻(xiàn)報道Dietrich及其同事曾從Pedobacterheparinus細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)其他與糖代謝密切相關(guān)的酶,如軟骨素酶、肝素合成酶、硫酸酯酶、硫代酰胺酶等[22],且這些酶在實(shí)際的糖合成應(yīng)用中都具有較高的價值,證實(shí)Pedobacterheparinus菌株可以作為研究糖代謝途徑相關(guān)酶的重要基因庫[23]。本文是首次從Pedobacterheparinus基因組中克隆表達(dá)得到了一種新的具有較高活性的唾液酸醛縮酶,豐富了該酶的資源。后續(xù)將進(jìn)一步開展對該酶的生物酶學(xué)特性以及實(shí)際應(yīng)用效果的研究,為該酶的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

在構(gòu)建重組蛋白酶的工程菌過程中,選擇合適的表達(dá)載體作為骨架尤其關(guān)鍵。表達(dá)載體的核心則是啟動子,其直接影響目的基因表達(dá)方式的經(jīng)濟(jì)性以及重組蛋白的表達(dá)水平。在大腸桿菌系統(tǒng)中,應(yīng)用較多的是帶有l(wèi)ac/trc/tac以及T7啟動子的系列表達(dá)載體[24],其中pET系列載體是該類載體的典型代表。本研究中也選擇了以含有T7·lac啟動子的pET-30a為載體,構(gòu)建重組唾液酸醛縮酶表達(dá)體系,實(shí)驗結(jié)果證明該重組體系僅需以廉價的IPTG為乳糖類似物誘導(dǎo)劑即可表達(dá)獲得濃度較高的重組唾液酸醛縮酶,載體C端帶有的組氨酸標(biāo)簽也解決了目前野生型菌株中低量唾液酸醛縮酶難以分離純化等問題。但隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,通常需要表達(dá)載體能夠進(jìn)一步滿足更經(jīng)濟(jì)、更簡便的調(diào)控方式的需要,因此組成型啟動子的研究應(yīng)用越來越廣泛。國內(nèi)杜麗琴等人曾報道過從宏基因文庫中克隆出組成型啟動子構(gòu)建至T-載體中[25],成功利用構(gòu)建的含組成型的啟動子表達(dá)出了具有活性的淀粉酶,但其組成型啟動子的篩選步驟繁瑣,得到陽性克隆子的成功率低,且該改造后的載體只含有單個多克隆酶切位點(diǎn)。本研究則以啟動抗性基因表達(dá)的調(diào)控序列為組成型啟動子,對商業(yè)載體pRSF-Duet1進(jìn)行改造,方法簡易可行。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRSF-EM7-PhNeuLy3300在無任何誘導(dǎo)劑添加的情況下成功表達(dá)出了具有活性較強(qiáng)的唾液酸醛縮酶,大大降低了唾液酸醛縮酶的表達(dá)成本。

本文只利用該改造的pRSF-EM5載體進(jìn)行了唾液酸醛縮酶的表達(dá)。實(shí)際上本研究改造后的載體理論上能同時獨(dú)立自主表達(dá)5種蛋白酶,并在本實(shí)驗室開展的大腸桿菌體內(nèi)合成糖胺聚糖的研究中成功實(shí)踐了兩種基因的共表達(dá)。該研究將編碼UDP-葡萄糖異構(gòu)酶及β-1,4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因同時串接至pRSF-EM5載體上,使其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中自主表達(dá),并以大腸桿菌體內(nèi)糖代謝中的UDP-葡萄糖為底物,同時外源補(bǔ)給pNP-木糖受體,在共表達(dá)的兩種重組酶作用下,于大腸桿菌體內(nèi)檢測到了合成的pNP-木糖-半乳糖,即pRSF-EM5載體可于同一宿主菌株中同時表達(dá)兩種目的蛋白酶且兼具活性?？偠灾?該組合型表達(dá)載體的成功構(gòu)建進(jìn)一步提供了組成型啟動子在多基因共表達(dá)的實(shí)現(xiàn)過程中的可能性,為生物體內(nèi)多酶法的合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文通過對商業(yè)載體pRSF-Duet1進(jìn)行定向改造,合成了可自主表達(dá)多種外源蛋白的RSF-EM5載體,利用PCR法成功獲得了Pedobacterheparinus菌株中參與合成唾液酸的唾液酸醛縮酶基因,該基因長度約為945 bp。同時采用基因工程技術(shù)將該唾液酸醛縮酶基因分別連至大腸桿菌pET 30a載體及RSF-EM5載體,成功構(gòu)建了兩種重組唾液酸醛縮酶質(zhì)粒。經(jīng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)兩種重組質(zhì)粒均能有效表達(dá)目的蛋白酶,其分子量大小與預(yù)期相符,且具有較高的催化活性。目前課題組正在研究該酶的酶學(xué)特性及其在生物內(nèi)體合成唾液酸的應(yīng)用,以期進(jìn)一步探索該酶的實(shí)用價值。