, ,*,, ,*,
(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院,民族藥物研究所,四川成都 610041;2.樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,四川樂(lè)山 614004)
爬沙蟲(chóng)是廣翅目巨齒蛉屬(Acanthcorydalis)和部分大型齒蛉屬(Neoneuromus)幼蟲(chóng)的俗稱(chēng),主要分布于四川攀西及云南大理、麗江、西雙版納等地[1],民間認(rèn)為爬沙蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)豐富,在攀西地區(qū)享有“蟲(chóng)參”、“安寧土人參”和“動(dòng)物人參”的美譽(yù)[2-3]。課題組考證表明,爬沙蟲(chóng)在彝族、白族、哈尼族、納西族等多民族長(zhǎng)期使用,不僅是一種特色食用昆蟲(chóng),還是一味民間藥,具暖腎陽(yáng)、療腎虛之效,是治療小兒遺尿、老人體虛夜尿的特效藥[4-5]。然而,目前對(duì)于爬沙蟲(chóng)的藥用價(jià)值相關(guān)的研究極少,僅吉首大學(xué)研究發(fā)現(xiàn)爬沙蟲(chóng)提取液可提高果蠅繁殖力及壽命,同時(shí),一定濃度爬沙蟲(chóng)提取液可提升小鼠繁殖力[6-7]。
目前,世界上可作食用的昆蟲(chóng)種類(lèi)達(dá)3000種以上[8]。2003 年聯(lián)合國(guó)糧食(WHO)與農(nóng)業(yè)組織(FAO)推動(dòng)食用昆蟲(chóng)的利用,預(yù)示著昆蟲(chóng)正在扮演新型蛋白資源及食物資源的角色[9-11],具有巨大的研發(fā)潛力[12]。同時(shí),研究表明多數(shù)食用昆蟲(chóng)兼具藥用價(jià)值[13]。然而,目前對(duì)于食用昆蟲(chóng)的研究主要集中于其營(yíng)養(yǎng)成分的研究[14-15],對(duì)藥理活性較少,許多藥食兩用昆蟲(chóng)藥用價(jià)值尚缺實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
下尿路癥狀(LUTS)儲(chǔ)尿期癥狀臨床上主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、夜尿、尿多等[16],可引發(fā)包括前列腺疾病、膀胱過(guò)度活動(dòng)癥、夜尿癥等疾病[17-20]。目前臨床上治療LUTS儲(chǔ)尿期癥狀的藥物主要有去氨加壓素、抗毒蕈堿藥、α-受體阻滯劑、M受體拮抗劑等[21-23]。然而,此類(lèi)藥物具有易引起患者口干、便秘、視覺(jué)模糊、眩暈、腸胃不適、排尿困難、心悸、性功能障礙等副作用[24-25],尤其不適于老人及兒童使用。而來(lái)自天然的食用資源具有毒副作用低、可接受度高等優(yōu)點(diǎn),因此,以食用資源為思路,開(kāi)發(fā)一種具有良好抗利尿作用的藥食兩用資源對(duì)LUTS儲(chǔ)尿期癥狀的治療具有重要意義。然而,目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)學(xué)者對(duì)爬沙蟲(chóng)抗利尿作用進(jìn)行研究。故本研究對(duì)食用昆蟲(chóng)爬沙蟲(chóng)主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析,并研究其抗利尿作用,以期促進(jìn)爬沙蟲(chóng)資源的全面開(kāi)發(fā),為爬沙蟲(chóng)的食用與藥用提供科學(xué)依據(jù)。
爬沙蟲(chóng) 于2017年12月購(gòu)自云南西雙版納,保存于西南民族大學(xué)416實(shí)驗(yàn)室冰箱冷凍層,經(jīng)樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院曹成全教授鑒定為爬沙蟲(chóng)主流品種之一的屬模巨齒蛉Acanthacorydalisasiatice(Wood-Mason,1884);健康雄性SD大鼠、KM小鼠雌雄各半,SPF級(jí) 均購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK[川]2015-030),動(dòng)物分組分籠飼養(yǎng)于正常環(huán)境中,溫度18~25 ℃,相對(duì)濕度為60%±5%,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),可自由攝食、飲水;縮泉丸 吉林龍?chǎng)嗡帢I(yè)有限公司;大鼠酶聯(lián)免疫AVP、ALD試劑盒 美國(guó)R&D公司;0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)pH6.5(自配);牛血清蛋白(≥98%)對(duì)照品,西寶生物科技股份有限公司;無(wú)水葡萄糖 成都德斯特生物技術(shù)有限公司。
DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn);UPH-Ⅱ-10T優(yōu)普超純水制造系統(tǒng) 成都超純科技有限公司生產(chǎn);RJ-TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī) 無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司;SL-100高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市松青五金廠;MB-580酶標(biāo)分析儀 深圳市匯松科技發(fā)展有限公司;L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司;PD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;代謝籠 自制。
1.2.1 樣品處理 爬沙蟲(chóng)洗凈后于-40 ℃冷凍干燥機(jī)中干燥72 h,置粉碎機(jī)內(nèi)打粉5 min,過(guò)60目篩,粉末置0 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 可溶性蛋白含量的測(cè)定 對(duì)照品溶液的制備:取牛血清蛋白對(duì)照品0.025 g,加純水100 mL,制成0.25 mg/mL的對(duì)照品溶液。
“課程思政”作為一種新的思想政治工作理念,本質(zhì)上是“課程承載思政,思政寓于課程”,即讓所有課程都上出思政味,讓所有任課教師都挑起思政擔(dān),從而形成全員育人、全方位育人的思政教育新格局?!罢n程思政”可以將思想政治教育滲透到一切知識(shí)的傳授、應(yīng)用之中,從而實(shí)現(xiàn)工具理性與價(jià)值理論的統(tǒng)一。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL,定容至1.0 mL,加5 mL考馬斯藍(lán),反應(yīng)5 min。另取蒸餾水1.0 mL,同上操作加入5 mL考馬斯藍(lán)進(jìn)行顯色反應(yīng),作為空白對(duì)照。于最大吸收波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度,以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0143x+0.0561,R2=0.9995。
稱(chēng)取爬沙蟲(chóng)粗粉2 g,置具塞錐形瓶中,加入50 mL蒸餾水,60 ℃水浴2 h,抽濾,取濾液,重復(fù)提取3次,合并濾液,將濾液濃縮至50 mL,濃縮液于5000 r/min離心15 min,取上清液即得蛋白樣品液。取0.1 mL樣品液純水定容至1 mL,加考馬斯亮藍(lán)工作液5 mL,混勻后于595 nm處測(cè)定吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蛋白含量[26-27]。
1.2.3 多糖含量測(cè)定 對(duì)照品溶液的制備:取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加水制成92.9 mg/100 mL的溶液,即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液20、40、60、80、100 μL,分別置于比色管中,加蒸餾水定容至1.0 ml,加入5 %苯酚1.0 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5 mL,沸水浴15 min。另取蒸餾水1.0 mL,同上操作加入5 %苯酚和濃硫酸進(jìn)行顯色反應(yīng),作為空白對(duì)照。于最大吸收波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.007x-0.0429,R2=0.9932。
稱(chēng)取爬沙蟲(chóng)粗粉2 g,置索氏提取器中,加入石油醚150 mL于90 ℃水浴下回流提取2 h,棄去石油醚,收集殘?jiān)?,揮干溶劑,置圓底燒瓶中,加水50 mL,50℃水浴回流提取2次,每次2 h,合并提取液,將提取液濃縮50 mL。精密吸取上法操作所得溶液1 mL,加入1 mL 5%苯酚溶液,搖勻后快速加入濃硫酸5 mL,沸水浴15 min后冷卻,得多糖供試液,于490 nm處測(cè)定吸光度,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算多糖含量[28]。
1.2.4 油脂含量測(cè)定 稱(chēng)取爬沙蟲(chóng)粗粉2 g,記為M,粉末包于濾紙內(nèi),置索氏提取器中,加入50 mL乙醚,沸水浴加熱回流8 h至油脂提取完全,將提取液至于恒重蒸發(fā)皿中,蒸發(fā)皿質(zhì)量記為mL,100 ℃水浴揮干乙醚,后烘箱內(nèi)100 ℃烘干至恒重,稱(chēng)定蒸發(fā)皿加油脂重量,記為m2,根據(jù)下式計(jì)算出爬沙蟲(chóng)油脂含量。
1.2.5 有機(jī)酸含量測(cè)定 稱(chēng)取爬沙蟲(chóng)粗粉2 g,記為M,加30 mL 95%乙醇,于索式提取器中80 ℃水浴提取2 h,提取液濃縮至10 mL,取濃縮液1 mL稀釋5倍,稀釋液加0.5 g活性炭脫色30 min,隨后加入酚酞指示液2滴,用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至溶液出現(xiàn)粉紅色為止,記錄氫氧化鈉體積V。每1 mL 0.1 mol/L NaOH滴定液相當(dāng)于6.404 mg的枸櫞酸,爬沙蟲(chóng)有機(jī)酸含量以枸櫞酸含量表示,根據(jù)下式計(jì)算有機(jī)酸含量[29-30]。
1.2.6 水分及氨基酸含量測(cè)定 水分采用直接干燥法測(cè)定,稱(chēng)量爬沙蟲(chóng)鮮蟲(chóng)重量,隨后將爬沙蟲(chóng)鮮蟲(chóng)置于40℃烘箱中干燥24 h至恒重,稱(chēng)量干蟲(chóng)重量,根據(jù)下式計(jì)算爬沙蟲(chóng)水分含量。
氨基酸測(cè)定參照GB/T 5009.124-2003中《食品中氨基酸的測(cè)定》,采用蛋白水解液于氨基酸自動(dòng)分析儀中測(cè)定氨基酸含量[31]。
上述實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3次。
1.2.7 爬沙蟲(chóng)抗利尿作用
1.2.7.1 藥液的制備及動(dòng)物篩選 爬沙蟲(chóng)粉末用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分別配制為67.2、33.6、16.8 mg/mL混懸液,陽(yáng)性藥縮泉丸以相同方法配制為150 mg/mL混懸液,藥液均置于4 ℃冰箱備用,用時(shí)搖勻。仿Aston法對(duì)SD大鼠進(jìn)行篩選,即于實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水,每只大鼠灌胃38 ℃純水22.5 mL/kg,收集灌胃2 h之后的尿液,凡尿量超過(guò)灌注體積40%者即為合格[32]。
1.2.7.2 分組及給藥 取篩選合格大鼠48只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、水負(fù)荷模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、爬沙蟲(chóng)混懸液高、中、低劑量組。高劑量組采用67.2 mg/mL爬沙蟲(chóng)混懸液液、中劑量組為33.6 mg/mL爬沙蟲(chóng)混懸液、低劑量組為16.8 mg/mL爬沙蟲(chóng)混懸液、陽(yáng)性藥組為150 mg/mL縮泉丸混懸液,分別按10 mL/kg灌胃給予大鼠,給藥干預(yù)20 d,空白組、模型組灌胃等體積生理鹽水。給藥第19 d當(dāng)晚,大鼠禁食不禁水12 h過(guò)夜,除空白組外,各組于第20 d給藥后1 h按大鼠體重(50 mL/kg)灌胃生理鹽水造成水負(fù)荷[33-36],隨后將所有大鼠置于代謝籠內(nèi)測(cè)定0~5 h每小時(shí)尿量。根據(jù)下式計(jì)算尿量體重比及排泄率。
1.2.7.3 血清指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠股動(dòng)脈取血,血樣于4 ℃冰箱內(nèi)放置1 h,隨后3500 r/min離心10 min,收集血清。血清抗利尿激素(AVP)、醛固酮(ALD)含量的檢測(cè)均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
營(yíng)養(yǎng)成分結(jié)果見(jiàn)表1,由表1可知,爬沙蟲(chóng)水溶性蛋白、多糖含量分別為4.87%±0.03%、1.90%±0.09%,油脂、有機(jī)酸、水分含量分別為16.45%±0.70%、3.54%±0.06%、71.51%±0.66%。目前,動(dòng)物蛋白及多糖已被證明具有多種生物活性。動(dòng)物蛋白可分離出多種活性肽,這類(lèi)活性肽具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用,同時(shí),有研究表明昆蟲(chóng)體內(nèi)存在抗利尿肽[37-39],由此推測(cè)爬沙蟲(chóng)抗利尿作用的產(chǎn)生可能與其體內(nèi)存在的某種肽類(lèi)物質(zhì)有關(guān);動(dòng)物多糖亦被證明具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖血脂、抗氧化抗衰老等作用[40],爬沙蟲(chóng)多糖也可能是其具有藥用價(jià)值的原因之一。
表1 爬沙蟲(chóng)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的含量Table 1 Nutritional components contents in hellgrammites
爬沙蟲(chóng)20種常用氨基酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,由表2可知,爬沙蟲(chóng)水解后共測(cè)出14種氨基酸,其中必需氨基酸7種,非必需氨基酸7種,總氨基酸含量為52.01 g/100 g。爬沙蟲(chóng)含有的鮮味氨基酸如丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸的含量決定了味道的鮮美程度[41-42],而爬沙蟲(chóng)氨基酸中,丙氨酸含量最高,達(dá)7.46%,天冬氨酸、精氨酸的含量分別為6.10 g/100 g和2.03 g/100 g,鮮味氨基酸占總氨基酸含量的29.98%,這可能是爬沙蟲(chóng)味道鮮美,當(dāng)?shù)厝讼彩车脑蛩?。同時(shí),爬沙蟲(chóng)藥效氨基酸含量較高,為25.62 g/100 g,占總氨基酸含量的49.26%,這表明爬沙蟲(chóng)具有較好的藥用及保健的開(kāi)發(fā)價(jià)值。此外,爬沙蟲(chóng)中EAA/TAA=48.18%,EAA/NEAA=92.99%,與WHO/FAO提出的優(yōu)質(zhì)蛋白中EAA/TAA不低于40%,EAA/NEAA不低于60%相符[43],表明爬沙蟲(chóng)氨基酸配比合理,可做為優(yōu)質(zhì)蛋白的選擇。
表2 爬沙蟲(chóng)的氨基酸含量Table 2 Amino acids composition in hellgrammites
采用氨基酸比值系數(shù)法對(duì)爬沙蟲(chóng)中必需氨基酸與WHO/FAO提出的理想人體必需氨基酸模式譜進(jìn)行比較,比較結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,爬沙蟲(chóng)中各必需氨基酸均高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)[37],這進(jìn)一步說(shuō)明了爬沙蟲(chóng)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其中苯丙氨酸與酪氨酸含量約為WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)的3倍,苯丙氨酸可經(jīng)氧化產(chǎn)生成為酪氨酸,兩者可一起參與神經(jīng)遞質(zhì)與激素的合成,參與機(jī)體的糖代謝及脂代謝,這可能與民間與爬沙蟲(chóng)的藥用價(jià)值存在一定的聯(lián)系。
表3 必需氨基酸占總氨基酸的含量及其與WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比Table 3 Content of essential amino acids in total aminoacids and comparison with WHO/FAO standards
2.3.1 對(duì)大鼠尿量的影響 由表4可知,模型組尿量體重比較之正常組顯著增加(p<0.01)。0~1 h內(nèi),中、低劑量組尿量體重比極顯著高于模型組(p<0.01),高劑量組、陽(yáng)性藥組與模型組比較無(wú)顯著差異,說(shuō)明尚未起效;1~2 h內(nèi),除低劑量組外,各給藥組尿量體重比均顯著低于模型組(p<0.05);2~3 h各給藥組均起效,尿量體重比均顯著低于模型組(p<0.05)。2 h后,爬沙蟲(chóng)低劑量組排尿量極顯著低于陽(yáng)性藥組(p<0.01),3~4 h中、低劑量組排尿量均極顯著低于陽(yáng)性藥組(p<0.01)。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn),高劑量組5 h中排尿規(guī)律與陽(yáng)性藥組幾乎一致,但5 h尿液總量較之陽(yáng)性藥組降低了10.48%,說(shuō)明爬沙蟲(chóng)在水負(fù)荷條件下的抗利尿作用略強(qiáng)于陽(yáng)性藥,具有較好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。各組總尿量體重比較之模型組均顯著降低(p<0.05),各給藥組較之模型組尿量體重比降低率分別為高劑量組30.08%、中劑量組29.65%、低劑量組19.27%以及陽(yáng)性藥組19.60%。
表4 爬沙蟲(chóng)對(duì)水負(fù)荷大鼠尿量的影響Table 4 Effect of hellgrammites on urine volume of water-loaded
由表5可知,各給藥組排泄率均顯著低于模型組(p<0.01),以平均值計(jì)算各給藥組較之模型組的降低率,得到降低率分別為高劑量組30.36%、中劑量組25.39%、低劑量組18.89%以及陽(yáng)性藥組23.21%。爬沙蟲(chóng)高劑量組排泄率較之陽(yáng)性藥組降低了7.15%,但各給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組之間未見(jiàn)顯著性差異。抗利尿效果根據(jù)排泄率進(jìn)行排序,抗利尿效果為爬沙蟲(chóng)高劑量組>中劑量組>陽(yáng)性藥組>低劑量組。
表5 爬沙蟲(chóng)對(duì)水負(fù)荷大鼠排泄率的影響Table 5 Effect of hellgrammites on theexcretion rate of water-loaded
2.3.2 對(duì)AVP、ALD的影響 如圖1所示,模型組AVP含量較之空白組極顯著降低(p<0.05),高劑量組極顯著高于模型組(p<0.01),其余各組較之模型組AVP含量升高但未見(jiàn)顯著性差異(p>0.05),高劑量組AVP含量較之陽(yáng)性藥組有所升高,但未見(jiàn)顯著性差異。模型組ALD含量較之空白組顯著降低(p<0.01),各給藥組ALD含量較之模型組均顯著升高(p<0.05);各給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組間未見(jiàn)顯著性差異。
圖1 爬沙蟲(chóng)對(duì)水負(fù)荷模型大鼠血清AVP、ALD含量水平的影響Fig.1 Effects of hellgrammites on the content of AVP and ALD in serum of water-loaded
精氨酸加壓素(AVP)又稱(chēng)抗利尿激素(ADH),為一種9肽物質(zhì),它能與遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞管周膜的特異受體結(jié)合,激活膜內(nèi)的腺苷酸環(huán)化酶,使上皮細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷增加,導(dǎo)致管腔膜內(nèi)蛋白激酶激活,使蛋白磷酸化改變膜的構(gòu)型,導(dǎo)致水通道開(kāi)放,增加管腔膜對(duì)水的通透性,促進(jìn)水重吸收,從而起到減少尿量的作用[8]。有研究表明,自然衰老大鼠血中ADH明顯減少[19-21],老年人夜間AVP釋放水平降低,夜間多尿是常見(jiàn)癥狀[44]。本次實(shí)驗(yàn)中,與模型組比較,爬沙蟲(chóng)高劑量組大鼠血清AVP含量顯著升高(p<0.05),中劑量組及低劑量組亦有所升高,升高程度排序?yàn)楦邉┝拷M>中劑量組>低劑量組,這與爬沙蟲(chóng)抗利尿效果的排序相一致,可推測(cè)爬沙蟲(chóng)抗利尿作用可能是通過(guò)促進(jìn)AVP釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
醛固酮(ALD)是腎上腺鹽皮質(zhì)激素的主要成分,是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞合成的一種甾體激素,主要作用為保鈉排鉀,從而減少尿液的排泄[16-17]。本次研究的結(jié)果表明,與模型組對(duì)比,爬沙蟲(chóng)各給藥組ALD含量均顯著升高(p<0.05),升高程度排序?yàn)榈蛣┝拷M>中劑量組>高劑量組,這與爬沙蟲(chóng)抗利尿作用效果排序相反,推測(cè)爬沙蟲(chóng)可能不是通過(guò)促進(jìn)ALD的釋放起到抗利尿作用。
通過(guò)對(duì)爬沙蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)成分分析表明其營(yíng)養(yǎng)豐富,其中可溶性蛋白、多糖含量可觀,氨基酸配比合理,各必需氨基酸含量均超高于WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn),可作為優(yōu)質(zhì)蛋白的原料選擇。同時(shí),這些含量豐富的成分不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也往往是藥用昆蟲(chóng)的生物活性物質(zhì),如蜂肽、天蠶素類(lèi)抗菌肽、土鱉蟲(chóng)多糖以及白蠟蟲(chóng)多糖等。本研究中爬沙蟲(chóng)凍干粉表現(xiàn)出了良好的抗利尿活性,實(shí)驗(yàn)表明其凍干粉可明顯減少大鼠尿量,這種作用的產(chǎn)生可能是通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的一種9肽物質(zhì)——抗利尿激素(AVP)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,而這種藥用活性的物質(zhì)基礎(chǔ)是否與爬沙蟲(chóng)的蛋白類(lèi)、多糖類(lèi)物質(zhì)有關(guān),值得進(jìn)一步研究。