三七近紅外多指標(biāo)快速質(zhì)量評(píng)價(jià)

周雨楓， 董林毅， 楊哲萱， 張鳳蓮， 章順楠， 周立紅?， 葉正良，3?

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；2.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，中藥先進(jìn)制造技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津300410；3.天士力控股集團(tuán)有限公司，天津300410）

三七 Panax notoginseng（Burk.） F.H.Chen為五加科人參屬植物的干燥根和根莖物［1］，屬于珍貴的中藥材。具有止血、活血化瘀、降血壓、降血脂等多種作用。近年來(lái)，隨著三七產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，三七不同藥用部位的開(kāi)發(fā)研究越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。

三七按部位分類，分為主根、筋條 （側(cè)根）、絨根 （須根）、剪口、花、葉6個(gè)部位，文獻(xiàn)指出，三七不同部位內(nèi)在成分含有量差異，可能影響臨床用藥的安全性與有效性［2］。數(shù)據(jù)顯示，生產(chǎn)合格的三七粉，在投料時(shí)需考慮不同藥用部位的質(zhì)量特征［3］。但傳統(tǒng)分析方法鑒別三七粉來(lái)源時(shí)，存在耗時(shí)長(zhǎng)、前處理復(fù)雜等缺點(diǎn)，且對(duì)于不同部位的三七粉，單獨(dú)采取傳統(tǒng)某種分析方法，無(wú)法對(duì)各部位判別分析，需多種分析方法綜合應(yīng)用，且隨著摻雜成分的不同，鑒別結(jié)果變數(shù)也大［4-5］。 《中國(guó)藥典》規(guī)定三七飲片可以直接以粉入藥，主要有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和 Rb1。但沒(méi)有規(guī)定三七粉的原料來(lái)源，藥材經(jīng)過(guò)粉碎后，失去了原來(lái)的形狀特征［6］，容易摻偽。而且市售的三七主根粉容易摻雜其余部位，卻仍以主根粉原價(jià)出售，并且難以通過(guò)感官辨別。

近年來(lái)，近紅外光譜技術(shù)在中藥行業(yè)得到大力推廣，作為一種藥材快檢的高效分析方法而被廣泛應(yīng)用［3］，并應(yīng)用于三七粉末的來(lái)源和真?zhèn)舞b別［7-9］，但目前尚未有報(bào)道利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)三七主根、筋條 （側(cè)根）、絨根 （須根）、剪口、花、葉等所有部位的粉末進(jìn)行判別分析。

本研究以三七的皂苷含有量為質(zhì)控指標(biāo)，利用NIRS結(jié)合PLS建立皂苷模型。同時(shí)結(jié)合主成分分析對(duì)三七不同部位分別進(jìn)行定性鑒別，應(yīng)用于三七主根粉的偽品分析，建立快速實(shí)用的多指標(biāo)分析方法，為中藥材的整體質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考［10］。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 WATERS 269高效液相色譜儀 （美國(guó) WATERS公司）；Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪馬科技有限公司）；XS205電子分析天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；AntarisⅡ傅立葉變換近紅外光譜儀 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；DK-S14電熱恒溫水浴鍋 （上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；MEMMERT UNE200干燥箱 （上海美墨爾特貿(mào)易有限公司）；高速中藥粉碎機(jī) （山東省青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司）。乙腈 （批號(hào) 10900830728，色譜純）、甲醇 （批號(hào)10901407732，色譜純）（德國(guó)默克股份兩合公司）；甲醇 （批號(hào)2017112032，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；三七皂苷R1（批號(hào)20130910，含有量92.78%）、人參皂苷Rg1（批號(hào)20130911，含有量94.63%）、人參皂苷Rb1（20131107，含有量95.87%）均由天士力醫(yī)藥股份有限公司提供；水為Milli-Q超純水。

1.2 藥材 三七主根53批，三七剪口、絨根、筋條、花、葉各5批，均由天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司提供，經(jīng)浙江理工大學(xué)梁宗鎖教授鑒定為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.） F.H.Chen的主根、筋條、絨根、剪口、花、葉。藥材粉碎，過(guò)65目藥典標(biāo)準(zhǔn)篩，分別混勻，裝袋密封備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 參考藥典方法［1］，測(cè)得主根皂苷含有量范圍為5.85%～9.27%、筋條為5.69%～6.39%、剪口為10.12%～11.90%、絨根為4.48%～6.62%、花為2.51%～5.28%、葉為0.38%～0.69%，見(jiàn)表1。

表1 各樣品中皂苷含有量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of content determination of the saponins of various samples

2.2 光譜采集 采集方式為積分球固體采樣。樣品掃描次數(shù)64次，分辨率8.0 cm－1，每個(gè)樣品采集2張光譜，計(jì)算平均光譜以建立模型。各部位三七主根的近紅外原始光譜見(jiàn)圖1。

圖1 各樣品不同部位近紅外光譜圖Fig.1 Near-infrared spectra of different parts of various samples

2.3 皂苷含有量模型

2.3.1 校正集和驗(yàn)證集 應(yīng)用TQ Analyst 8.0軟件，從53批樣品中選擇具有代表性的43批作為校正集，含有量范圍分別為5.85%～9.27%，10批為驗(yàn)證集，含有量范圍為6.09%～8.96%，驗(yàn)證集的含有量范圍均在校正集之內(nèi)，具有可驗(yàn)證性。

2.3.2 光譜預(yù)處理 近紅外光譜中除了自身的光譜信息外，還容易受到儀器噪音以采集時(shí)固體粉末的顆粒大小和均一性的影響。在近紅外定性模型中，常用的預(yù)處理方法有多元散射校正法（MSC）、 標(biāo)準(zhǔn)歸一化法 （SNV）、 一階導(dǎo)數(shù)法（FD） 等［11-12］。 以 內(nèi) 部 交 叉 驗(yàn) 證 均 方 差（RMSECV）和R2作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，見(jiàn)表2，一階導(dǎo)數(shù)得到的模型數(shù)據(jù)最好。

表2 不同預(yù)處理方法的影響Tab.2 Effects of different spectra preprocessing methods

2.3.3 選擇建模波段 建模波段選擇范圍過(guò)窄，缺乏關(guān)鍵信息，范圍過(guò)寬又會(huì)包含大量的噪音和多余信息，因此，選擇最佳波段有利于提高模型的預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性［11］。由主根近紅外譜圖可知，7 500～12 000 cm－1吸收較少， 3 800～4 000 cm－1儀器噪音比較大，不適于建模。因此選擇在 4 000～7 500 cm－1嘗試建模，以 R2、RMSECV為評(píng)價(jià)指標(biāo)，手動(dòng)篩選后見(jiàn)表3。表明，4 100～7 250 cm－1為最佳建模波段。

表3 不同波長(zhǎng)范圍的影響Tab.3 Effects of different wavelength coverage

2.3.4 主成分?jǐn)?shù) 主成分?jǐn)?shù)量過(guò)多，模型太復(fù)雜，出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象。數(shù)量太少，則提取的信息不全面，模型的預(yù)測(cè)性降低［11］。本實(shí)驗(yàn)以RMSECV為優(yōu)化參數(shù)，RMSECV越小，模型的預(yù)測(cè)精度越高［13］，因此，確定最佳因子數(shù)為9。見(jiàn)圖2。

圖2 RMSECV隨主因子數(shù)變化Fig.2 Changes of the RMSECV along with factors

2.3.5 建立定量模型 運(yùn)用TQ Analyst 8.0軟件，通過(guò)PLS法對(duì)三七主根的皂苷含有量建立定量模型。外部驗(yàn)證中實(shí)測(cè)值與參考值的相關(guān)圖見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，RMSECV為0.278，R2為0.919 1，表明該模型的總體預(yù)測(cè)性高。

圖3 實(shí)測(cè)值與參考值的相關(guān)性Fig.3 Correlation between measured values and reference values

2.3.6 模型的驗(yàn)證 根據(jù)2015版 《中國(guó)藥典》HPLC法測(cè)定的皂苷含有量作為實(shí)測(cè)值，與近紅外光譜建模后得到的預(yù)測(cè)值相比，見(jiàn)表4～5。表明，所建模型外部驗(yàn)證集的實(shí)測(cè)值與參考值最大絕對(duì)誤差0.25，平均相對(duì)誤差為1.52%，t檢驗(yàn)P值為0.210＞0.05，表明驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)值與參考值之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明，所建模型準(zhǔn)確性高，預(yù)測(cè)性能好。

表4 模型驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Results of the modelling verification

表5 驗(yàn)證集參數(shù)比較Tab.5 Comparison of parameter of validation set

2.4 各部位判別分析定性模型

2.4.1 選擇訓(xùn)練集與驗(yàn)證集 78批樣品中隨機(jī)選擇5批主根，筋條、絨根、剪口、花、葉各1批作為驗(yàn)證集，其余作為訓(xùn)練集。訓(xùn)練集樣本68批，驗(yàn)證集樣本10批。

2.4.2 光譜預(yù)處理 應(yīng)用TQ Analyst對(duì)樣品建立NIR判別分析定性模型時(shí)，判別分析的錯(cuò)誤類別越少，正確率越高。主分成因子分析區(qū)域貢獻(xiàn)值越大表明信息越豐富，但超過(guò)95后表明光譜中噪聲對(duì)樣品自身信息干擾大，所以需要盡量控制低于95。并綜合考慮各個(gè)類別的第1主成分和第2主成分的二維散點(diǎn)圖中的區(qū)域分布是否明顯來(lái)選擇最佳的預(yù)處理方法。由表6～7得出，MSC＋一階導(dǎo)數(shù)作為預(yù)處理方法正確率最高，分析區(qū)域貢獻(xiàn)值最大。

表6 不同預(yù)處理方法的影響Tab.6 Effects of different preprocessing methods

表7 不同預(yù)處理方法的分析區(qū)域貢獻(xiàn)值Tab.7 Contribution values of different preprocessing methods to the analysis area

2.4.3 建模波段 建模波段選擇過(guò)寬，包含的冗余信息較多，使得模型的預(yù)測(cè)性降低；選擇過(guò)窄，對(duì)應(yīng)波段的信息不夠豐富，沒(méi)有代表性，判別分析正確率低。近紅外定性分析時(shí)，波段靠近4 000 cm－1方向是合頻區(qū)，越靠近往小的方向，峰的區(qū)分效果越好，重疊性越小，5 000 cm－1以上屬于倍頻區(qū)，越大峰形重疊越嚴(yán)重，而越靠近10 000 cm－1峰幾乎都是重疊在一起。通過(guò)觀察譜圖差異主要在3 800～7 500 cm－1，經(jīng)過(guò)不斷手動(dòng)優(yōu)化嘗試后，得到3 807.15～6 500.00 cm－1為最佳建模波段。見(jiàn)表8。

表8 不同波長(zhǎng)范圍的影響Tab.8 Effects of different wavelength coverage

2.4.4 主成分判別分析模型建立 經(jīng)過(guò)上述分析，選擇 MSC＋一階導(dǎo)數(shù)作為光譜預(yù)處理方法，3 807.15～6 500.00 cm－1為最佳建模波段，建立近紅外判別分析模型。見(jiàn)圖4。

2.4.5 模型驗(yàn)證與評(píng)價(jià) 將選擇的10批樣品作為驗(yàn)證集來(lái)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批驗(yàn)證集樣品的類別鑒別正確率為100%。由此可得，模型的準(zhǔn)確度高，預(yù)測(cè)性能好，可用于三七不同部位的定性鑒別。

圖4 三七不同部位第1、第2主成分得分圖Fig.4 Scores of the first and second principal components for different parts of Panax．notoginseng

2.5 三七粉偽品

2.5.1 三七偽品制備 三七花和三七葉的顏色相對(duì)主根而言比較深，顏色區(qū)分度比較明顯，而筋條、絨根和剪口粉末顏色與主根接近，肉眼難以準(zhǔn)確區(qū)分是否三七粉中摻有這些雜質(zhì)，因此隨機(jī)選擇1批三七主根、筋條、絨根、剪口，將三者按不同比例進(jìn)行混合，見(jiàn)表9，每份樣品10 g，得到15種摻雜粉。

2.5.2 近紅外光譜采集 分別將上述偽品粉末取約5 g置于旋轉(zhuǎn)樣品杯中，積分球固體采樣，掃描次數(shù)64次，分辨率8.0 cm－1，每個(gè)樣品采樣2次取平均光譜以建立模型。

2.5.3 主成分判別分析 將15份偽品作為驗(yàn)證集，帶入建立的近紅外不同部位判別分析定性模型中，結(jié)果表明，該模型對(duì)三七粉中分別摻雜絨根10%、筋條45%、剪口60%及以上的偽品三七粉均可鑒別。見(jiàn)圖5。

表9 不同比例主根與其他部位混合鑒別情況Tab.9 Mixed identification of different proportions of taproot and other parts

3 討論

3.1 NIRS與HPLC對(duì)比 NIRS具有高效、無(wú)損、綠色、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)在線分析和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并且沒(méi)有復(fù)雜的前處理過(guò)程，能對(duì)三七各個(gè)部位通過(guò)模型進(jìn)行鑒別。然而近紅外光譜測(cè)定的是倍頻及合頻吸收，因此靈敏度較差，通常要求檢測(cè)含有量大于1%；并且NIRS作為一種間接分析方法，需要大量的建模數(shù)據(jù)，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，分析方法的精確性以及化學(xué)計(jì)量學(xué)選擇的合理性等，都會(huì)影響最終的模型精度和預(yù)測(cè)性能［14］。而HPLC法可以定量測(cè)定物質(zhì)含有量，數(shù)據(jù)精準(zhǔn)，但前處理復(fù)雜繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且難以通過(guò)皂苷含有量來(lái)區(qū)分三七藥材的不同部位。綜合比較得出，近紅外光譜技術(shù)在推廣應(yīng)用，需要有精確的一級(jí)數(shù)據(jù)和合理的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。

圖5 摻雜三七粉的第一、第二主成分的得分圖Fig.5 Scores of the first and second principal components of adulterated Panax．Notoginseng powders

3.1 定量研究 文獻(xiàn)表明，三七不同部位總皂苷溶血性小，且三七主根總皂苷的免疫增強(qiáng)作用最好［15］。多糖組分在免疫調(diào)節(jié)方面活性顯著，而三七不同部位中多糖含有量有明顯差異，主根、筋條、毛根、花、莖葉和剪口中均含有多糖，其中主根含有量最高，莖葉含有量最低［16］。主根、筋條、剪口中的皂苷含有量和種類均不同，質(zhì)量也有差異［17］。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得三七不同部位中，剪口皂苷含有量最高，其次主根，接著是筋條和絨根，二者含有量范圍非常接近，而且與主根的含有量范圍有重疊部位，接下來(lái)是花和葉，葉中皂苷含有量測(cè)定范圍最低。在建立的皂苷含有量近紅外模型中，實(shí)測(cè)值平行樣品間最大偏差為1.91%，驗(yàn)證集樣品的最大相對(duì)誤差為3.42%，平均相對(duì)誤差為1.52%，表明該模型準(zhǔn)確性、預(yù)測(cè)性都較高。

3.2 NIR判別分析 目前企業(yè)生產(chǎn)時(shí)通常選擇三七不同部位的原材料進(jìn)行加工，市售合格三七粉通常是以三七主根作為原材料，三七的筋條和須根雖然都有一定的藥用價(jià)值。但相對(duì)主根而言含有量較低，因此售價(jià)便宜，而剪口中皂苷含有量雖然比主根高，但不容易被人體直接吸收，通常用于企業(yè)制藥。三七的筋條和絨根也有一定的藥用價(jià)值，但有效成分相對(duì)較低，因此相對(duì)主根價(jià)格低廉。剪口主要成分含有量指標(biāo)要遠(yuǎn)高于法定標(biāo)準(zhǔn)，但剪口和筋條的灰分指標(biāo)有不符合標(biāo)準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)［3］。

本實(shí)驗(yàn)利用NIRS建立三七不同部位的主成分判別分析模型中，選擇MSC和一階導(dǎo)數(shù)作為預(yù)處理方法，3 807.15～6 500.00 cm－1為最佳建模波段，78批樣品中1批分類錯(cuò)誤，驗(yàn)證集分類正確率100%，總樣品分類正確率為98.72%。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)性能和提高模型的實(shí)用性，將三七摻雜粉作為驗(yàn)證集帶入主成分判別分析模型中，在判別分析模型中，筋條、絨根和剪口含有量分別為10%、45%、60%及以上的三七摻雜粉均被鑒定出不是主根類別。經(jīng)過(guò)主成分分析后，圖5表明，隨著三七粉偽品中筋條、絨根和剪口的比例不斷增加，數(shù)據(jù)點(diǎn)不斷從主根分布區(qū)域向這三個(gè)部位的分布區(qū)域移動(dòng)，表9表明，三七偽品模型鑒別準(zhǔn)確率高。

3.3 質(zhì)量評(píng)價(jià) 本文采用近紅外光譜法，對(duì)三七主根皂苷含有量建立了定量分析模型，對(duì)三七藥材所有部位的鑒別建立了快速無(wú)損的定性分析方法。該模型經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，對(duì)三七主根粉偽品同樣具有良好的鑒別能力，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。結(jié)果表明，近紅外光譜技術(shù)高效、便捷，可從定量和定性等多方面對(duì)三七藥材進(jìn)行整體質(zhì)量評(píng)價(jià)，后期可通過(guò)不斷增加樣品量來(lái)提高各個(gè)模型的預(yù)測(cè)性和實(shí)用性。