circ-ITCH表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)聯(lián)及對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡作用的影響

梁楊煥

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位居世界女性全身惡性腫瘤的第7位和第4位[1]。根據(jù)2015年全球腫瘤流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，2012年全球約有239 000例新發(fā)EOC和151 900例死于EOC的患者[2]。2016年中國(guó)腫瘤流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示，2015年新發(fā)EOC和死于EOC的病例分別為52 100和22 500例[3]。盡管近年早期診斷、個(gè)體化治療及患者護(hù)理技術(shù)等均有所提高和發(fā)展，但EOC患者的病死率仍呈上升趨勢(shì)，晚期患者的5年生存率不及30%[1]，可能與極高的惡性程度、易復(fù)發(fā)性以及易轉(zhuǎn)移性有關(guān)[4]。因此，積極探索EOC的發(fā)病機(jī)制，提高EOC的早期診斷率、發(fā)現(xiàn)可靠的治療靶基因是有必要的。

環(huán)狀RNA分子(circular RNA, circRNA)區(qū)別于傳統(tǒng)的線性RNA(linear RNA，含5′和3′末端)，是一類(lèi)不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴、并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，其封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)不受RNA外切酶的影響，表達(dá)更穩(wěn)定且不易降解[5]。據(jù)報(bào)道，circRNA與宮頸癌、胃癌以及結(jié)腸癌等腫瘤具有密切的聯(lián)系，并可通過(guò)直接或者間接調(diào)節(jié)許多基因或信號(hào)通路來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]。circ-ITCH作為一個(gè)新穎的circRNA位點(diǎn)，已被證實(shí)在肝細(xì)胞癌、肺癌及食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用[9-11]。本研究旨在評(píng)估組織circ-ITCH的表達(dá)水平與EOC患者的臨床病理特征及總體生存期(overall survival, OS)的關(guān)聯(lián)，并探討circ-ITCH對(duì)EOC細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2013年10月-2016年7月接受手術(shù)切除的EOC患者122例，年齡(53.24±10.15)歲(24～76歲)?；颊叩幕厩闆r見(jiàn)表1。所有患者均經(jīng)臨床和病理學(xué)檢查確診，年齡≥18歲，且在醫(yī)院樣本庫(kù)中存有可用于定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè)的癌組織和配對(duì)癌旁組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性卵巢癌患者；(2)有其他腫瘤病史，或之前接受過(guò)卵巢癌手術(shù)的患者；(3)臨床和病理資料不完整或缺失的患者。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2方法

1.2.1信息采集和樣本采集 通過(guò)醫(yī)院的電子病歷系統(tǒng)或病案室記錄，收集患者的臨床病理資料，包括年齡、組織學(xué)亞型、病理分級(jí)、腹膜細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果、腫瘤大小、腹水量、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)、糖類(lèi)抗原125(carbohydrate antigen 125, CA125)的水平和生存資料。所有患者均依據(jù)其疾病狀況和意愿進(jìn)行隨訪，中位隨訪時(shí)間為30月(1～57月)，隨訪截止日期為2017年10月1日。OS定義為患者手術(shù)后至任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。從醫(yī)院樣本庫(kù)中獲得所有入組患者手術(shù)切除并保存于液氮中的癌組織和配對(duì)癌旁組織樣本。

表1 患者的基本信息

EOC：上皮性卵巢癌；FIGO分期：國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期；CA125：糖類(lèi)抗原125.

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人類(lèi)EOC細(xì)胞(SKOV3細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，加入含10%胎牛血清、2 μmol/L左旋谷丙酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(11885084，美國(guó)Gibco公司)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 質(zhì)粒設(shè)計(jì)委托上海巧捷生物科技有限公司進(jìn)行，質(zhì)粒構(gòu)建合成委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行。將NC1(+)、NC2(-)、circ-ITCH (+)及circ-ITCH (-)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)SKOV3細(xì)胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，分為NC1(+)、NC2(-)、circ-ITCH (+)及circ-ITCH (-)組。

1.2.4qPCR 采用Trizol Reagent (15596018, 美國(guó)Invitrogen公司)抽提總RNA。利用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。將RNA分為RNase消化組和非消化組2組，準(zhǔn)備10×Reaction Buffer配制10 μL總反應(yīng)體系，用于消化線性RNA，每1 μg RNA用1 U的RNase消化，37 ℃ 10 min。采用苯酚和乙醇沉淀法提取消化產(chǎn)物。采用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis Super Mix (11752050, 美國(guó)Invitrogen公司)合成cDNA。采用TB GreenTMFast qPCR Mix (RR430A, 日本Takara公司)完成qPCR的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，然后按95 ℃ 1 min→60 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參。運(yùn)用2-ΔΔCt來(lái)計(jì)算qPCR的結(jié)果。引物序列如下：

circ-ITCH：

正向：5′-GCAGAGGCCAACACTGGAA-3′

反向：5′-TCCTTGAAGCTGACTACGCTGAG-3′

GAPHD：

正向：5′-GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3′

反向：5′-ATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3′

1.2.5CCK-8檢測(cè) 取各組細(xì)胞，胰酶消化后分別加入96孔板中，加入CCK-8后，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定0,24,48 h的吸光度(optical density, OD)值，繪制增殖曲線。

1.2.6AV/PI檢測(cè) 胰酶消化和PBS沖洗后，細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入100 mL Binding buffer清洗和重懸細(xì)胞，加入5 mL AV-FITC，在室溫下黑暗處孵育15 min。加入5 mL PI，室溫下黑暗處孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以頻次(%)表示。采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)癌組織和癌旁組織中circ-ITCH的表達(dá)差異；Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析circ-ITCH表達(dá)在不同臨床病理特征亞組中的差異；Kaplan-Meier(K-M)曲線和Log-rank檢驗(yàn)分析circ-ITCH表達(dá)水平和患者OS的關(guān)聯(lián)。采用單元和多元Cox風(fēng)險(xiǎn)比回歸模型對(duì)影響OS的因素進(jìn)行分析，單元Cox回歸模型中P<0.1的因素進(jìn)一步納入多元Cox回歸模型。采用t檢驗(yàn)評(píng)估兩組間SKOV3細(xì)胞增殖和凋亡的差異。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1circ-ITCH在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異 與癌旁組織[1.570(1.077～2.598)]比較，circ-ITCH在癌組織中[0.576(0.262～1.063)]的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01，圖1)。

P<0.001.圖1 circ-ITCH在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異Fig 1 The differential expression of circ-ITCH in tumor tissue and adjacent tissue

2.2circ-ITCH和臨床病理特征的關(guān)聯(lián) 癌組織中circ-ITCH的表達(dá)水平，病理分級(jí)G1/2的患者[0.872(0.466～1.347)]高于G3患者[0.469(0.240～0.953)](P=0.008)，腫瘤≤10 cm的患者[0.849(0.312～1.217)]高于>10 cm患者[0.484(0.233～0.817)](P=0.023)，F(xiàn)IGO分期Ⅰ/Ⅱ的患者[1.119(0.767～1.850)]高于Ⅲ/Ⅳ的患者[0.366(0.217～0.686)](P<0.001，圖2)。此外，組織circ-ITCH表達(dá)水平與其他臨床病理特征無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

2.3circ-ITCH表達(dá)水平對(duì)OS的影響 根據(jù)癌組織中circ-ITCH的表達(dá)水平將患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，并進(jìn)一步采用K-M曲線和Log-rank檢驗(yàn)分析組織circ-ITCH的表達(dá)水平與EOC患者OS的關(guān)聯(lián)。高表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間為41月(14～57月)，低表達(dá)組患者為20月(1～57月)；高表達(dá)組比起低表達(dá)組患者有更好的OS(P=0.002，圖2)。

A：年齡≥50歲與<50歲患者比較； B：組織亞型為漿液性與其他患者比較； C：病理分級(jí)G1/2與G3患者比較；D：細(xì)胞學(xué)檢查陽(yáng)性與陰性患者比較；E：腫瘤大小≥10 cm與<10 cm的患者比較；F：腹水量≥100 mL與<100 mL的患者比較；G：FIGO分期為Ⅲ/Ⅳ與Ⅰ/Ⅱ的患者；H：CA125≥1 000 U/mL與<1 000 U/mL的患者比較; circ-ITCH表達(dá)水平對(duì)OS的影響.圖2 circ-ITCH和臨床病理特征的關(guān)聯(lián)以及對(duì)OS的影響Fig 2 The correlation of circ-ITCH and clinicopathologic features and the relationship of circ-ITCH expression with OS

2.4影響OS的因素 癌組織circ-ITCH的高表達(dá)水平(P=0.003)與患者更好的OS相關(guān)，而病理學(xué)分級(jí)(G3vsG1/2) (P=0.012)、細(xì)胞學(xué)檢查陽(yáng)性(P=0.019)、腹水量≥100 mL(P=0.023)、FIGO分期(Ⅲ/ⅣvsⅠ/Ⅱ) (P=0.001)與患者更差的OS相關(guān)。進(jìn)一步采用多元Cox′s回歸模型分析EOC患者OS的預(yù)測(cè)因素(單元模型中P<0.1的因素)，結(jié)果顯示，癌組織circ-ITCH高表達(dá)水平(P=0.012)能獨(dú)立預(yù)測(cè)EOC患者較好的OS，而細(xì)胞學(xué)檢查陽(yáng)性(P=0.019)及腹水量≥100 mL (P=0.005)能獨(dú)立預(yù)測(cè)EOC患者較差的OS(表2)。

表2 影響總體生存期的因素

FIGO分期：國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期；CA125：糖類(lèi)抗原125.

2.5circ-ITCH (+)/(-)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 為進(jìn)一步探討circ-ITCH在EOC的功能，進(jìn)一步行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染circ-ITCH (+)/(-)后，采用qPCR實(shí)驗(yàn)分析RNA的表達(dá)。光鏡下顯示，NC1(+)、circ-ITCH(+)、NC2(-)及circ-ITCH(-)組中轉(zhuǎn)染率均超過(guò)90%(圖3A)。此外，轉(zhuǎn)染circ-ITCH(+)后，circ-ITCH的表達(dá)水平比NC1(+)組顯著增加(P<0.000 1)，而轉(zhuǎn)染circ-ITCH(-)后，circ-ITCH的表達(dá)水平比NC2(-)組顯著減少(P<0.000 1，圖3B)，表明轉(zhuǎn)染成功。

a:NC1(+)； b:circ-ITCH(+); c:NC2(-); d:circ-ITCH(-). A：細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖；B：circ-ITCH相對(duì)表達(dá)量，☆☆☆:P<0.000 1.圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fig 3 Cell transfection

2.6circ-ITCH對(duì)EOC細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染circ-ITCH(+)/(-)后，采用CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，48 h后，circ-ITCH(+)組的細(xì)胞增殖比NC1(+)組顯著減少(P<0.05)，而circ-ITCH (-)組的細(xì)胞增殖比NC2(-)組顯著增加(P<0.05，圖4)，表明circ-ITCH有抑制EOC腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

2.7circ-ITCH對(duì)EOC細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染circ-ITCH (+)/(-)后，采用AV/PI實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，circ-ITCH(+)組的細(xì)胞

與NC2(-)組比較，☆：P<0.05; 與NC1(+)組比較，#：P<0.05.圖4 細(xì)胞增殖檢測(cè)Fig 4 Cell proliferation assay

凋亡率較NC1(+)組明顯增加(P<0.05)，而circ-ITCH(-)組較NC2(-)組明顯減少(P<0.05，圖5)，表明circ-ITCH有促進(jìn)EOC腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

A：細(xì)胞凋亡流式圖；B：細(xì)胞凋亡率,☆:P<0.05.圖5 細(xì)胞凋亡Fig 5 Cell apoptosis

3 討 論

circRNA作為一種非編碼RNA，具有高度保守性、穩(wěn)定性及特異性，其主要生物功能如下：(1)可順式調(diào)控親本基因的表達(dá)；(2)可結(jié)合吸附miRNA，從而降低miRNA的活性，間接調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)；(3)有較強(qiáng)的組織表達(dá)特異性，未來(lái)可作為疾病(尤其是腫瘤)診斷和治療的潛在靶點(diǎn)[12-14]。研究表明，circRNA與腫瘤關(guān)系密切。例如CDR1as，ciRS-7-A，circ7374，circ3204或circ0817等與宮頸癌、乳腺癌、胃癌或結(jié)腸癌等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6,13,15-17]。一項(xiàng)有關(guān)肝細(xì)胞癌的研究表明，circRNA has_circ_0001649在癌組織中相較于癌旁組織的表達(dá)水平顯著下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤的大小和門(mén)靜脈癌栓呈負(fù)相關(guān)[18]。此外，另一項(xiàng)有關(guān)胃癌的研究表明，circRNA has_circ_002059在癌組織中表達(dá)明顯減少，其表達(dá)水平與患者的TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均呈負(fù)相關(guān)[19]。上述研究均說(shuō)明circRNA在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。

circ-ITCH作為一種新穎的circRNA，位于染色體20q11.22[10]。一項(xiàng)有關(guān)食管鱗狀細(xì)胞癌的研究表明，與癌旁組織比較，circ-ITCH在癌組織中的表達(dá)水平顯著降低[11]。同樣，另一項(xiàng)有關(guān)肝細(xì)胞癌的研究表明，circ-ITCH在癌組織中的表達(dá)水平亦明顯減少[9]。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展涉及諸多基因和信號(hào)通路的復(fù)雜調(diào)控。為了進(jìn)一步了解circ-ITCH在EOC的具體機(jī)制，筆者研究了circ-ITCH對(duì)EOC細(xì)胞增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示，circ-ITCH可減少EOC細(xì)胞增殖，而增加EOC細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，少量研究報(bào)道了關(guān)于circ-ITCH在惡性腫瘤的細(xì)胞機(jī)制，如circ-ITCH可通過(guò)海綿吸附作用抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而減少ESCC細(xì)胞增殖[11]；circ-ITCH同樣可通過(guò)吸附致癌性miR-7和miR-214抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活動(dòng)性，從而降低肺癌細(xì)胞的增殖[10]；circ-ITCH可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-224和miR-17上調(diào)P21和磷酸酶基因，從而抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，繼而減少膀胱癌惡化[20]?？梢?jiàn)，circ-ITCH可通過(guò)發(fā)揮生物調(diào)控功能，如海綿吸附作用等，影響細(xì)胞活動(dòng)，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。這可能是circ-ITCH減少EOC細(xì)胞增殖、而增加EOC細(xì)胞凋亡的部分原因。

綜上所述，癌組織circ-ITCH與EOC的病理分級(jí)、腫瘤大小及FIGO分期均呈負(fù)相關(guān)，而與OS呈正相關(guān)。此外，circ-ITCH可減少EOC細(xì)胞增殖，且增加細(xì)胞凋亡。