國(guó)產(chǎn)妥布霉素滴眼液質(zhì)量評(píng)價(jià)

于明艷 耿雪 張乃斌 張冬梅 李玉杰 祝清芬 凌霄

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101)

妥布霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能夠在細(xì)菌核糖體30S和50S亞基的聯(lián)結(jié)位置聯(lián)結(jié)，阻礙70S復(fù)合物的形成，使mRNA不能翻譯成蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。主要對(duì)革蘭陰性菌，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、克雷伯菌、變形菌、檸檬酸桿菌有效。臨床主要用于結(jié)膜炎、角膜炎等眼部細(xì)菌感染，特別是對(duì)慶大霉素耐藥的革蘭陰性菌感染，如嚴(yán)重的銅綠假單胞菌感染有效[1-3]。

妥布霉素滴眼液于1981年3月15日由美國(guó)愛爾康公司研究上市，商品名“TOBREX”。其主要用于敏感細(xì)菌所致的外眼及附屬器的局部感染。不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為偶見局部刺激癥狀，不宜與其他腎毒性或耳毒性藥物合用或先后應(yīng)用[4-5]。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)共31家，批準(zhǔn)文號(hào)37個(gè)；國(guó)外在華注冊(cè)企業(yè)1家，進(jìn)口批準(zhǔn)文號(hào)1個(gè)，規(guī)格均為0.30%(3mg/mL)。按裝量標(biāo)示，有5、8、9、10和0.4mL的包裝規(guī)格。目前僅中國(guó)藥典二部及美國(guó)藥典(USP)41收載妥布霉素滴眼液[1,6]。2018年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)共抽取到174批次妥布霉素滴眼液，旨在客觀地評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)藥品的質(zhì)量現(xiàn)狀，分析產(chǎn)品的主要質(zhì)量問題，進(jìn)而明確產(chǎn)品質(zhì)量提高的方向。本文依據(jù)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)結(jié)果結(jié)合探索性研究，對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的妥布霉素滴眼液產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行了系統(tǒng)性分析研究，并提出對(duì)現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)的建議。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器)；Q ExactiveTM超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)；Agilent 7890氣相色譜儀-7697頂空進(jìn)樣器；Mass Frontier 7.0軟件(Thermo Fisher Scieni fi c, MA, USA)；Mettler MS105DU電子天平；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert公司)；高壓蒸汽滅菌器(日本Sanyo公司)；酶標(biāo)儀(美谷生物)；MJ-250I霉菌培養(yǎng)箱；GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 試藥

妥布霉素對(duì)照品：批號(hào)：130527-200402，含量：91.4%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新酶胺對(duì)照品：批號(hào)：130411-200908，含量：100%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；卡那霉素B對(duì)照品：批號(hào)：130548-200501，含量：100%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；尼泊拉胺對(duì)照品：批號(hào)：10-RAJ-168-2，含量：95%(硫酸鹽形式)，購(gòu)自Toronto Research Chemicals(TRC)；脫氧鏈酶胺卡那胺對(duì)照品(雜質(zhì)D、妥布霉素A)：批號(hào)：9-KPA-46-1，含量：97.95%，購(gòu)自TRC；苯扎溴銨：批號(hào)：135051-201401，10.9mg/mL，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；苯扎氯銨：批號(hào)：1300549-201504，12.19mg/mL，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；羥苯乙酯：批號(hào)：100847-201604，含量：99.9%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；羥苯丙酯：批號(hào)：100444-201403，含量：99.6%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硫柳汞鈉：批號(hào)：143172，含量：96.6%，購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer GmbH C 17515000；乙腈(Merck)、乙醇(科密歐)、二甲基亞砜(科密歐)、均為色譜純；三羥甲基氨基甲烷購(gòu)自國(guó)藥，批號(hào)：20160907，含量≥99.0%；2,4-二硝基氟苯：購(gòu)自Tokyo Chemical Industry(TCI)，批號(hào)：68XD2378，含量＞99.05%；DPBS緩沖液，批號(hào)：20180712，購(gòu)自Hyclone公司；MTT，批號(hào)：MKBL3665V，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；異丙醇，批號(hào)：20160928，購(gòu)自天津市康科德技術(shù)有限公司；組織培養(yǎng)液B，批號(hào)：20180831，購(gòu)自廣東博溪生物科技有限公司。Bio OcullarTMRHE三維角膜模型，批號(hào)：OT180803，購(gòu)自廣東博溪生物科技有限公司

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104] 3-20180709-2、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003] 3-20180712-2、大腸埃希菌[CMCC(B)44102] 3-20180630-1、黑曲霉[CMCC(F)98003] 3-20180713-2；白念珠菌[CMCC(F)98001] 3-20180619-1，以上菌種購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，工作菌種為第三代。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：172441)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：172401)均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉(批號(hào)：20171030)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

妥布霉素滴眼液174批次均為2018年國(guó)家計(jì)劃抽驗(yàn)樣品，來源于21家生產(chǎn)企業(yè)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 法定檢驗(yàn)

根據(jù)各廠家藥品批準(zhǔn)文號(hào)信息，按2015年版中國(guó)藥典或國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(YBH02042016/YBH08652009/YBH17182006)進(jìn)行法定檢驗(yàn)。

2.2 探索性研究

根據(jù)法定檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)檢索情況，圍繞著藥品安全性、有效性和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可控性，進(jìn)一步開展雜質(zhì)譜分析、有關(guān)物質(zhì)、抑菌劑眼刺激性、抑菌效力等項(xiàng)目的探索性研究。

2.2.1 雜質(zhì)譜分析

色譜條件：Agilent Zorbax S B-C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流動(dòng)相：10mmol/L三氟乙酸；柱溫：40℃；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用加熱ESI源，正/負(fù)離子模式。加熱ESI離子源參數(shù)如下：

毛細(xì)管電壓：3200V(正負(fù)離子模式)噴霧電壓為3.0kV，毛細(xì)管溫度和霧化器分別為350和250℃。鞘氣和輔助氣分別設(shè)為275.58和103.4kPa, S-lens RF電壓為50V。噴霧氣和碰撞氣均為氮?dú)?。掃描方式采用正離子Full MS/dd-MS2模式，此模式包含1次一級(jí)全掃描(分辨率70000FWHM)和1次數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描(分辨率17500FWHM)2個(gè)事件。一級(jí)全掃描范圍為m/z 100～1000，自動(dòng)增益控制(AGC)和離子注入時(shí)間(IT)分別設(shè)為1.0e6和100ms；數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)掃描(dd-MS2)AGC設(shè)為2.0e5，最大IT設(shè)為50ms，觀察窗(isolation window)設(shè)為1.0m/z，未充滿系數(shù)(underfill ratio)設(shè)為1.0%，強(qiáng)度閾(intensity threshold)設(shè)為4.0e4，同位素排除(exclude isotopes)設(shè)為“on”，動(dòng)態(tài)排除(dynamic exclusion)設(shè)為10.0s;碰撞模式：高能量碰撞解離(HCD)；碰撞能量：NCE30，遞增率(Stepped)NCE 50%。

2.2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

色譜條件：乙腈和三羥甲基氨基甲烷(簡(jiǎn)稱Tris)溶液(取Tris2.0g加水溶解稀釋至800mL，加入1mol/L硫酸溶液20mL)作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，見表1。流速：1.2mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量20μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

衍生化處理方法：量取待衍生溶液適量，置于50mL容量瓶中，加水2mL 2,4-二硝基氟苯溶液10mL、三羥甲氨基甲烷試溶液10mL，搖勻，蓋上塞子，置于60℃水浴中加熱50min，取出，加乙腈至離刻度約2cm處，冷卻至室溫，加乙腈至刻度，搖勻，即得。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫Tab.1 The gradient elution table of HPLC mobile phase

2.2.3 抑菌劑眼刺激性

采用3D角膜上皮模型來評(píng)價(jià)不同抑菌劑的眼刺激反應(yīng)。3D角膜上皮模型以人角膜上皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，通過精細(xì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液成分，使細(xì)胞在體外分化形成3D角膜組織。具有與人角膜上皮高度相似的結(jié)構(gòu)與功能。該評(píng)價(jià)模型采用人源的角膜上皮模型與受試物相接觸，通過給藥后MTT細(xì)胞活性檢測(cè)方法測(cè)得模型ET50值，評(píng)估不同樣品的體外眼刺激性[7-8]。受試物采用的試驗(yàn)濃度為表2所示。

2.2.4 抑菌效力考察

將21家企業(yè)的產(chǎn)品按照中國(guó)藥典2015版通則[1121]抑菌效力檢查法進(jìn)行抑菌效力的考察。

3 結(jié)果及討論

3.1 法定檢驗(yàn)

174批次妥布霉素滴眼液依據(jù)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，173批次符合規(guī)定，1批次檢查項(xiàng)羥苯乙酯不符合規(guī)定，合格率99.4%。該不合格批次產(chǎn)品生產(chǎn)日期為2017年4月。經(jīng)分析，其不合格原因?yàn)椋?1)羥苯乙酯在堿性條件下不穩(wěn)定，該企業(yè)生產(chǎn)工藝中PH調(diào)節(jié)值高于大部分企業(yè)；(2)羥苯乙酯放置易降解，該不合格批次生產(chǎn)時(shí)間為2017年4月，屬于貨架末期產(chǎn)品；(3)經(jīng)調(diào)研其他企業(yè)多為高限投料，以保證貨架期產(chǎn)品羥苯乙酯檢查符合規(guī)定,該不合格批次生產(chǎn)企業(yè)羥苯乙酯投料量不能保證在效期內(nèi)降解后羥苯乙酯檢查合格。

表2 3D角膜上皮模型眼刺激性實(shí)驗(yàn)給藥孵育時(shí)間設(shè)計(jì)Tab.2 Incubation time for eye stimulation experiment using human cornea-like epithelial tissue model

3.2 現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)的問題

本次評(píng)價(jià)的妥布霉素滴眼液不同生產(chǎn)企業(yè)添加的抑菌劑種類不同。添加的抑菌劑涉及苯扎氯銨、苯扎溴銨、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉。其中硫柳汞鈉中含有汞，在人體中會(huì)有殘留富集作用，同時(shí)對(duì)眼表?yè)p傷較大，不建議作為抑菌劑在眼用制劑中使用。在標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一家企業(yè)使用硫柳汞鈉作為抑菌劑。

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)雜質(zhì)譜控制不全面。妥布霉素為發(fā)酵來源的抗生素，在發(fā)酵過程中易產(chǎn)生與其結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅控制單個(gè)雜質(zhì)及其他各雜質(zhì)的和，對(duì)特定雜質(zhì)沒有控制，無(wú)法評(píng)價(jià)不同企業(yè)產(chǎn)品間的雜質(zhì)譜的不同，進(jìn)而反映不同企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量差異。

3.3 雜質(zhì)譜分析

采用Q-Exacive Plus高分辨液質(zhì)對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)各生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品雜質(zhì)譜TIC一致，獲得一級(jí)離子豐度較高的4個(gè)雜質(zhì)，其[M+H]+分別為324.1765、323.1925、484.2613和307.1976。采用MassFrontier軟件推測(cè)4個(gè)雜質(zhì)可能為脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺和卡那霉素B。本研究通過購(gòu)買獲得了上述雜質(zhì)對(duì)照品，用Q-Exacive Plus高分辨液質(zhì)對(duì)雜質(zhì)對(duì)照品脫氧鏈霉胺卡那胺、新霉胺、卡那霉素B、尼泊拉胺進(jìn)行分析。將雜質(zhì)對(duì)照品一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜與妥布霉素滴眼液樣品中豐度較高的4個(gè)雜質(zhì)的一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)4個(gè)雜質(zhì)分別為脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺和卡那霉素B，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及信息見表3。

表3 4種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息Tab.3 Structural informations of four impurities

3.4 有關(guān)物質(zhì)研究

參照進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20100135色譜條件及柱前衍生的方法，采用的衍生化試劑為2,4-二硝基氟苯(DNFB)，在妥布霉素結(jié)構(gòu)中引入有紫外吸收的二硝基苯基基團(tuán)，使妥布霉素及其雜質(zhì)具有紫外吸收，進(jìn)而采用HPLC-UV的方法對(duì)其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查。將進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20100135流動(dòng)相條件由等度改成梯度洗脫，將經(jīng)高分辨液質(zhì)確認(rèn)的4個(gè)雜質(zhì)制訂入標(biāo)準(zhǔn)。新建立的有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠?qū)⒏鱾€(gè)雜質(zhì)與主峰進(jìn)行有效分離，同時(shí)排除輔料和抑菌劑對(duì)雜質(zhì)的干擾，特定雜質(zhì)的檢出由JX20100135的兩個(gè)(新霉胺、卡那霉素B)增加到4個(gè)(脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺、卡那霉素B)(圖1)。采用Gastrolplus公司ADMET predictor 9.0軟件對(duì)上述4個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)。各雜質(zhì)對(duì)大鼠和小鼠均有致癌性，其中脫氧鏈霉胺卡那胺和新霉胺還具有肝毒性。

3.5 抑菌劑的眼刺激性

采用3D角膜上皮模型評(píng)價(jià)抑菌劑眼刺激性，與傳統(tǒng)的兔眼刺激法相比，該評(píng)價(jià)體系數(shù)據(jù)客觀、靈敏度高，能夠避免動(dòng)物間的差異以及由動(dòng)物外推至人的種屬差異性。應(yīng)用該模型評(píng)價(jià)妥布霉素滴眼液中抑菌劑的眼刺激性，通過抑菌劑ET50的比較(ET50越小，眼刺激性越大)，以孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)，組織活性值作為縱坐標(biāo)作受試物溶液對(duì)組織活性影響作折線圖(圖2)。結(jié)果顯示羥苯乙酯、羥苯丙酯各處方濃度用量24h均未測(cè)到眼刺激性，硫柳汞鈉、苯扎氯銨、苯扎溴銨各處方濃度用量均表現(xiàn)出眼刺激性。具有刺激性的硫柳汞鈉、苯扎氯銨、苯扎溴銨在同一濃度(0.1mg/mL)下，刺激性程度依次為硫柳汞鈉＞苯扎氯銨(n-C12H25、n-C14H29取代)〉苯扎氯銨(n-C12H25取代)＞苯扎溴銨(圖3)。本次評(píng)價(jià)還發(fā)現(xiàn)n-C12H25、n-C14H29取代的苯扎氯銨刺激性大于n-C12H25取代的苯扎氯銨。在抑菌效力考察中，n-C12H25、n-C14H29取代的苯扎氯銨及n-C12H25取代的苯扎氯銨在同等的處方用量的情況下(0.1mg/mL)，對(duì)真菌和細(xì)菌的抑菌效力均能達(dá)到A級(jí)(表4)。建議滴眼劑中的苯扎氯銨使用刺激性較小的n-C12H25單體型苯扎氯銨。

3.6 抑菌效力的考察

圖1 系統(tǒng)適用性圖譜Fig.1 System suitability

圖2 抑菌劑對(duì)角膜組織活性的影響Fig.2 Effect of preservatives on corneal tissue activity

圖3 同一濃度(0.1mg/mL)下各抑菌劑刺激強(qiáng)度對(duì)比圖Fig.3 Contrast diagram of stimulus intensity of preservatives at the same concentration (0.1mg/mL)

妥布霉素滴眼液為抗生素類滴眼液，盡管抗生素有一定的抗菌作用，但是不同種類抗生素的抗菌譜不同，對(duì)抗菌譜以外的微生物起不到抑菌作用，因此多劑量眼用制劑應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)囊志鷦?，保證其在多次使用時(shí)不被微生物污染。本次評(píng)價(jià)對(duì)21家企業(yè)的妥布霉素滴眼液進(jìn)行抑菌效力研究，其中3家企業(yè)的產(chǎn)品未達(dá)到中國(guó)藥典2015年版眼用制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)。按照各企業(yè)抑菌劑使用情況，抑菌效力測(cè)定結(jié)果見表4。對(duì)各個(gè)廠家產(chǎn)品抑菌效力進(jìn)行分析，排除處方中除抑菌劑以外其他輔料的干擾。由于妥布霉素屬氨基糖苷類抗生素，對(duì)細(xì)菌的抑制作用較強(qiáng)，未添加抑菌劑和使用羥苯乙酯(處方濃度0.1mg/mL)的妥布霉素滴眼液對(duì)真菌的抑菌效力較差，未達(dá)到中國(guó)藥典2015年版眼用制劑抑菌效力的要求。苯扎溴銨抑菌效力較好，處方濃度為0.05、0.1和0.2mg/mL時(shí)抑菌效力均能達(dá)到A級(jí)，根據(jù)中國(guó)藥典2015四部抑菌效力中抑菌劑使用應(yīng)是最低有效濃度的原則，部分企業(yè)使用的苯扎溴銨的濃度未使用最低有效濃度，存在過量添加的問題。

4 結(jié)論

本次評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)妥布霉素滴眼液總體質(zhì)量一般，產(chǎn)品合格率為99.4%。不合格項(xiàng)目為抑菌劑羥苯乙酯的檢查。

探索性研究揭示，目前國(guó)產(chǎn)妥布霉素滴眼液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍有提高的空間，有關(guān)物質(zhì)、含量測(cè)定方法可做進(jìn)一步修訂。該品種不同企業(yè)抑菌劑添加的情況也不同，建議加強(qiáng)對(duì)抑菌劑處方篩選的研究。抑菌劑對(duì)眼部均有不同程度的刺激性，過量使用抑菌劑，將會(huì)給臨床用藥帶來安全隱患。同時(shí)眼用制劑中某些抑菌劑由于自身穩(wěn)定性的原因，抑菌劑的濃度會(huì)隨時(shí)間而逐漸降低，達(dá)不到有效濃度，不能保證藥品使用的安全。因此，抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制是保證多劑量包裝眼用制劑安全性、有效性的關(guān)鍵。

表4 抑菌效力測(cè)定結(jié)果Tab.4 Test results of bacteriostatic efficacy