紅鰭東方魚(yú)皮膠原低聚肽螯合鈣工藝優(yōu)化

, ,,,, ,劉英,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000; 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,河北秦皇島 066000)

紅鰭東方鲀?nèi)赓|(zhì)鮮美,是典型的高蛋白低脂肪的魚(yú)類(lèi),營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高。近年來(lái),隨著人工繁殖河豚技術(shù)的發(fā)展和苗種的成功培育,我國(guó)的紅鰭東方鲀達(dá)到了無(wú)毒級(jí),紅鰭東方鲀成為了我國(guó)最大的養(yǎng)殖河豚魚(yú)種之一[1]。膠原蛋白肽具有抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、降血壓以及美白補(bǔ)水等多種生理功效[2-5],有研究指出，河豚魚(yú)皮中的膠原蛋白含量占總蛋白含量的90%左右[6],含量豐富,如果能充分利用其膠原蛋白含量高這一特性,對(duì)魚(yú)皮進(jìn)行深加工,不僅能提高其利用價(jià)值，獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益,還能減少浪費(fèi)，避免環(huán)境污染。

鈣主要是以磷酸鈣的形式存在于人體的骨骼中,目前市場(chǎng)上的補(bǔ)鈣產(chǎn)品主要有碳酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣等,人體對(duì)這種電離鈣的吸收率較低，且如果補(bǔ)充電離鈣過(guò)度會(huì)影響人體健康,如出現(xiàn)便秘、脹氣、腹脹的不良反應(yīng)等[7]。膠原蛋白肽螯合鈣有望能克服電離鈣的缺點(diǎn):低濃度水平下的低吸收率和生物利用率以及高濃度水平下的生物毒性[8]。研究表明，人體對(duì)鈣的吸收是通過(guò)小腸刷狀緣分泌的氨基酸和小肽與Ca2+螯合成氨基酸或肽螯合物被小腸吸收進(jìn)入人體[9-11],膠原蛋白肽能刺激軟骨細(xì)胞合成膠原蛋白并影響膠原在骨關(guān)節(jié)中的轉(zhuǎn)化,因此膠原蛋白肽螯合鈣不僅促進(jìn)人體對(duì)鈣的吸收,還能發(fā)揮出膠原蛋白肽的功效[12-13]。梁春輝等[14]比較了膠原多肽螯合鈣、葡糖糖酸鈣和碳酸鈣對(duì)小鼠的壯骨作用,發(fā)現(xiàn)膠原蛋白肽螯合鈣對(duì)小鼠壯骨作用最為顯著。目前已經(jīng)有從鱈魚(yú)皮、白鰱魚(yú)骨、牡蠣、羅非魚(yú)皮、魚(yú)鱗、豬皮、牛骨等中提取的膠原蛋白進(jìn)行金屬螯合的報(bào)道以及各種氨基酸螯合金屬的研究[15-22]。從河豚魚(yú)皮提取膠原寡肽的研究較少,目前沒(méi)有關(guān)于河豚魚(yú)皮膠原寡肽螯合鈣的報(bào)道。

本研究以紅鰭東方鲀魚(yú)皮為原料，分析了反應(yīng)pH、肽鈣質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及膠原蛋白小肽濃度這五個(gè)因素對(duì)螯合率的影響,選取對(duì)螯合率影響最顯著的三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,確定出最佳工藝條件,并通過(guò)紅外光譜、紫外掃描對(duì)螯合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅鰭東方鲀魚(yú)皮 秦皇島;酸性蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氯化鈣 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鉀、硫化鈉 天津市歐博凱化工有限公司;檸檬酸鈉 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;鈣試劑 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；分子量不同的膠原蛋白肽 實(shí)驗(yàn)室自制。

TGL-18M離心機(jī) 上海盧湘儀器有限公司;pH-3C pH計(jì) 上海精科有限公司;UV-1700PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司;IRAffinity-1S傅里葉紅外檢測(cè)器 島津有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠原蛋白肽的制備 絞碎后的魚(yú)皮經(jīng)過(guò)前處理,在60 ℃水浴中提取6 h,紗布過(guò)濾除去魚(yú)皮,冷凍干燥得到膠原蛋白。在料液比1∶40 g/mL,加酶量5%,pH3的條件下利用酸性蛋白酶酶解3 h,100 ℃水浴滅酶活,7000 r/min離心得上清液,經(jīng)超濾得到不同分子質(zhì)量范圍的膠原蛋白肽。

1.2.2 膠原低聚肽螯合鈣制備方法 取適量膠原蛋白肽溶于水中,0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L NaOH調(diào)pH,加入適量的氯化鈣,控溫螯合,9倍體積的無(wú)水乙醇沉淀,沉淀20 min,7000 r/min離心10 min,去上清液,乙醇反復(fù)多次沖洗沉淀,真空冷凍干燥。

1.2.3 螯合率的測(cè)定 參照GB/T 5009.92-2016中的EDTA滴定法測(cè)定膠原低聚肽螯合鈣中的鈣含量。

取2 mL反應(yīng)液加入18 mL無(wú)水乙醇,取1 mL溶液測(cè)定其鈣含量,離心后取1 mL上清液測(cè)其中的鈣含量。按照下式計(jì)算螯合率。

螯合率(%)=(反應(yīng)液中鈣含量-上清液中鈣含量)/反應(yīng)液中鈣含量×100

1.2.4 最適分子質(zhì)量的膠原蛋白肽的篩選 Mr<1 kDa、1 kDa10 kDa的膠原蛋白肽分別用蒸餾水溶解,加入相同質(zhì)量的CaCl2,在pH為7,反應(yīng)溫度為50 ℃的條件下螯合50 min,測(cè)其螯合率,選取螯合率最高的分子質(zhì)量的肽段進(jìn)行下階段優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)考察了膠原低聚肽濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、肽鈣質(zhì)量比五個(gè)反應(yīng)因素對(duì)該實(shí)驗(yàn)的影響。

1.2.5.1 膠原低聚肽濃度對(duì)螯合率的影響 在反應(yīng)溫度為50 ℃,反應(yīng)時(shí)間50 min,肽鈣質(zhì)量比為5∶1,反應(yīng)pH為7的條件下對(duì)膠原蛋白低聚肽濃度分別為10、20、30、40、50、60 mg/mL的條件下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以螯合率為指標(biāo)確定出最佳膠原蛋白肽濃度。

1.2.5.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合率的影響 設(shè)定反應(yīng)溫度為50 ℃,肽鈣質(zhì)量比為5∶1,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL,分別控制反應(yīng)時(shí)間為10、30、50、70、90 min,以螯合率為指標(biāo)確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5.3 反應(yīng)溫度對(duì)螯合率的影響 在反應(yīng)時(shí)間50 min,肽鈣質(zhì)量比為5∶1,反應(yīng)pH為9,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL的條件下控制反應(yīng)溫度為35、40、45、50、55、60 ℃進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以螯合率為指標(biāo)確定最佳反應(yīng)溫度。

1.2.5.4 pH對(duì)螯合率的影響 設(shè)定反應(yīng)溫度為50 ℃,反應(yīng)時(shí)間50 min,肽鈣質(zhì)量比為5∶1,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL,分別在pH為5、6、7、8、9、10、11進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以螯合率為指標(biāo),確定出最佳pH。

1.2.5.5 肽鈣質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響 設(shè)定反應(yīng)溫度為45 ℃,反應(yīng)時(shí)間50 min,反應(yīng)pH為9,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL的條件下控制肽鈣質(zhì)量比分別為1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以螯合率為指標(biāo)確定最佳肽鈣質(zhì)量比反應(yīng)條件。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上按照Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理對(duì)此工藝進(jìn)一步優(yōu)化,響應(yīng)面編碼設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of Center combination of experiment

1.2.7 膠原低聚肽螯合鈣的紫外檢測(cè)分析 將膠原低聚肽和膠原低聚肽螯合鈣分別配制成濃度為2 mg/mL的樣品,用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為200～400 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

1.2.8 膠原低聚肽螯合鈣的紅外光譜分析 將膠原低聚肽和膠原蛋白低聚肽螯合鈣分別于干燥的KBr按照一定的比例進(jìn)行混合、研磨、壓片,利用傅里葉紅外光譜儀在4000～500 cm-1的范圍內(nèi)進(jìn)行掃描得到紅外光譜圖。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)應(yīng)用excel軟件繪制折線圖,應(yīng)用Design-expert. V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同肽段螯合鈣的螯合率

分子量較小的膠原蛋白肽能暴露出更多的基團(tuán)與鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng),由圖1可知，分子量小于1 kDa的肽與鈣的螯合效果最好,螯合率達(dá)到50.52%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他分子量的肽段,因此選擇分子量小于1 kDa的膠原低聚肽進(jìn)行螯合鈣的試驗(yàn)。

圖1 不同分子量的膠原蛋白肽與鈣的螯合情況Fig.1 Chelating rate of different molecular weight collagen peptides with calcium

2.2 膠原蛋白肽螯合鈣單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 膠原低聚肽濃度對(duì)螯合率的影響 由圖2可知,隨著膠原低聚肽濃度的升高,螯合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),并在膠原低聚肽濃度為40 mg/mL時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)膠原低聚肽濃度較小時(shí),溶液中的肽含量較少，不能與大量的鈣離子充分結(jié)合,當(dāng)膠原低聚肽濃度增加到一定值時(shí),肽含量達(dá)到飽和,膠原低聚肽中的-NH+和-COO-與鈣離子螯合時(shí)會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng),使肽與鈣離子的配位降低,螯合率下降。因此選擇40 mg/mL的膠原低聚肽為最佳螯合濃度。

圖2 膠原低聚肽濃度對(duì)螯合率的影響Fig.2 Effect of collagen peptide concentration on chelating rate

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合率的影響 由圖3所知,在所選擇的時(shí)間段內(nèi)螯合率變化較小,可見(jiàn)時(shí)間對(duì)膠原低聚肽和鈣離子的螯合效果影響較小。因此，響應(yīng)面試驗(yàn)中不再研究時(shí)間對(duì)膠原低聚肽和鈣離子螯合反應(yīng)的影響。

圖3 時(shí)間對(duì)螯合率的影響Fig.3 Effect of time on chelating rate

2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)螯合率的影響 由圖4可以看出,肽鈣螯合率隨著反應(yīng)溫度的變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在45 ℃達(dá)到最大值。隨著反應(yīng)溫度的升高,分子間的運(yùn)動(dòng)加劇,碰撞幾率增大有利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行,而當(dāng)溫度繼續(xù)升高,對(duì)多肽的性質(zhì)有一定影響,并且溫度較高，螯合物不穩(wěn)定易分解，使螯合率降低[23]。因此最適反應(yīng)溫度為45 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)螯合率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on chelating rate

2.2.4 pH對(duì)螯和率的影響 當(dāng)pH較低時(shí),溶液中的H+含量較高,會(huì)影響肽中的-COOH電離,同時(shí)較多的H+會(huì)和Ca2+爭(zhēng)奪供電子基團(tuán)-COO-,使螯合率降低。在pH到達(dá)9～10時(shí),溶液處于偏堿狀態(tài),OH-較多,有利于-COOH的電離生成H+,以及-NH2和OH-發(fā)生反應(yīng)生成-NH-,從而有利于和鈣離子的螯合[24],當(dāng)pH繼續(xù)上升，溶液中的OH-會(huì)和低聚肽供電子集團(tuán)爭(zhēng)奪Ca2+,生成Ca(OH)2,不利用螯合反應(yīng)。因此最適反應(yīng)pH為10。

圖5 pH對(duì)螯合率的影響Fig.5 Effect of pH on chelating rate

2.2.5 肽鈣質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響 由圖6可見(jiàn),肽鈣質(zhì)量比是影響肽鈣螯合率的一個(gè)重要因素,隨著肽鈣質(zhì)量比的提高,螯合率也呈上升趨勢(shì),在質(zhì)量比為25∶1之后，螯合率趨于平緩。若肽鈣質(zhì)量比過(guò)小,則氯化鈣添加過(guò)量,沒(méi)有足夠的基團(tuán)和鈣離子絡(luò)合,螯合率較低;若肽鈣質(zhì)量比過(guò)大,則氯化鈣添加量小,螯合反應(yīng)不完全,浪費(fèi)膠原低聚肽。螯合率相似時(shí),氯化鈣添加量越少,膠原低聚肽螯合鈣產(chǎn)物中鈣含量越低,所以本試驗(yàn)選擇15∶1、20∶1、25∶1三個(gè)水平的質(zhì)量比進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖6 肽鈣質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響Fig.6 Effect of peptide-calcium mass ratio on chelation rate

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及分析

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素間交互作用較強(qiáng),圓形則表示較弱[25]。同時(shí),等高線越稠密，說(shuō)明此因素對(duì)肽鈣螯合率的影響較強(qiáng),越稀疏,說(shuō)明該因素對(duì)肽鈣螯合率的影響越弱。圖7可以得出，溫度和肽鈣質(zhì)量比的等高線呈橢圓形,交互作用顯著。

圖7 各因素交互作用對(duì)螯合率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of interaction of various factors on chelation rate

由圖7a可見(jiàn),當(dāng)pH固定時(shí),螯合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在溫度為45 ℃左右時(shí)達(dá)到最高;當(dāng)溫度固定時(shí),螯合率在pH為9左右時(shí)達(dá)到最高;由圖7b可見(jiàn),當(dāng)肽鈣質(zhì)量比固定時(shí),螯合率在pH為9左右時(shí)達(dá)到最高,當(dāng)pH固定時(shí),螯合率在肽鈣質(zhì)量比為20∶1左右時(shí)達(dá)到最高;圖7c反映了溫度和肽鈣比交互作用對(duì)螯合率的影響,從響應(yīng)面圖可以看出,當(dāng)肽鈣質(zhì)量比固定時(shí),螯合率在45 ℃時(shí)達(dá)到最高,當(dāng)溫度固定時(shí),螯合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在肽鈣質(zhì)量比為20∶1時(shí)達(dá)到最高。

模型得到的最優(yōu)螯合條件是pH為9.18,肽鈣質(zhì)量比為20.55∶1,反應(yīng)溫度為45.27 ℃,在此條件下預(yù)測(cè)螯合率為89.98%?？紤]到實(shí)際條件將反應(yīng)溫度設(shè)定為45.3 ℃進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證此模型,得到的結(jié)果是螯合率為91.04%,與預(yù)測(cè)值接近。

2.3 紫外光分析

膠原低聚肽及膠原低聚肽螯合物的紫外吸收波長(zhǎng)如圖8所示,膠原低聚肽在226 nm處有最大吸收波長(zhǎng),膠原低聚肽螯合鈣最大波長(zhǎng)遷移至208 nm處,最大吸收峰發(fā)生了明顯的移位,而膠原蛋白肽在200～230 nm處的吸收峰是膠原多肽的羰基及肽鍵的特征吸收峰。膠原低聚肽與鈣離子螯合后相應(yīng)原子的價(jià)電子躍遷使其最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了改變,說(shuō)明了膠原低聚肽與鈣離子發(fā)生了螯合反應(yīng)。

圖8 膠原低聚肽與膠原低聚肽螯合鈣紫外可見(jiàn)光波長(zhǎng)掃描Fig.8 UV-visible wavelength scanning of collagen oligopeptide and collagen oligopeptide calcium-chelating calcium

2.4 紅外光譜分析

膠原蛋白酶解物的紅外光譜分析圖中會(huì)出現(xiàn)-NH2和-COOH的吸收峰,當(dāng)這些基團(tuán)與鈣離子螯合后,吸收峰會(huì)發(fā)生改變或偏移[26]。由圖9可見(jiàn),在酰胺A帶膠原低聚肽紅外光譜特征區(qū),由于N-H伸縮振動(dòng),-NH2在3311.78cm-1處具有吸收峰,而在膠原低聚肽螯合鈣中此吸收峰移至3315.63 cm-1;在酰胺Ⅰ帶,因?yàn)镃OO-的震動(dòng)收縮,C=O在1654.92 cm-1處具有吸收峰,而膠原低聚肽螯合鈣的C=O吸收峰移至1660.71 cm-1[26]。酰胺A帶和在酰胺Ⅰ帶都向高波數(shù)方向移動(dòng),且兩個(gè)區(qū)的吸收強(qiáng)度顯著增強(qiáng),說(shuō)明氨基和羧基都與鈣離子發(fā)生了螯合反應(yīng)。

圖9 膠原低聚肽和膠原低聚肽螯合鈣的紅外光譜圖對(duì)比Fig.9 Comparison of the infrared spectra of collagen oligopeptide and collagen oligopeptide calcium-chelating calcium

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析了pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間以及肽鈣質(zhì)量比對(duì)膠原低聚肽和鈣離子螯合作用的影響,然后選定pH、溫度、肽鈣質(zhì)量比進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到的最優(yōu)螯合條件是pH為9.18,肽鈣質(zhì)量比為20.55∶1,反應(yīng)溫度為45.3 ℃,在此條件下螯合率為91.04%,與預(yù)測(cè)值接近,響應(yīng)面優(yōu)化的最優(yōu)工藝條件可靠,可以用于實(shí)踐。對(duì)膠原寡肽螯合鈣通過(guò)紫外吸收光譜和紅外光譜分析,發(fā)現(xiàn)膠原低聚肽螯合鈣的吸收峰發(fā)生了位移,膠原低聚肽的氨基和羧基與鈣發(fā)生了螯合反應(yīng),證明膠原低聚肽與鈣生成膠原低聚肽螯合鈣。