基于高通量測(cè)序的江西特色發(fā)酵豆豉中微生物群落多樣性及其特征分析

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(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西南昌 330004; 2.廈門醫(yī)學(xué)院,福建廈門 361023; 3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

豆豉是一類利用微生物發(fā)酵黃豆或黑豆等原料而成的傳統(tǒng)調(diào)味副食品。豆豉歷史悠久,可追溯至兩千余年前的先秦時(shí)代,且分布廣泛,至今依然在我國(guó)江西[1]、云南[2]、湖南[3]、湖北[4]等地區(qū)及日本[5]、韓國(guó)[6]、印度[7]、泰國(guó)[8]、馬來(lái)西亞[9]等國(guó)家被人們制作食用。其中,江西豆豉精選優(yōu)質(zhì)黑豆,經(jīng)洗豆、泡豆、瀝干蒸制、冷卻接種、制曲及二次發(fā)酵而成,以江西南昌稻香園豆豉為典型代表,具有“顆粒完整、烏黑油亮、豉肉酥松、豉香濃郁”等特點(diǎn),歷來(lái)是我國(guó)江南百姓青睞的地方風(fēng)味特產(chǎn),也是藥食兩用淡豆豉的典型代表。然而,由于氣候、水土環(huán)境、風(fēng)味偏好等因素不同,各地的豆豉微生物種類組成差異明顯,極具地方特色。按照制曲及發(fā)酵過(guò)程及終成品的微生物區(qū)分,豆豉大致分為細(xì)菌、曲霉、毛霉、根霉和脈孢菌型等[10]。

傳統(tǒng)發(fā)酵類食品的微生物群落組成之前通常采用富集分離培養(yǎng)鑒定的方式分析,由于技術(shù)本身的局限,即使選擇更多的培養(yǎng)基和分離條件,也僅能分離出少量?jī)?yōu)勢(shì)菌群,不能反映其微生物群落的確切組成[2]。隨著低成本高通量測(cè)序服務(wù)的飛速發(fā)展,其在傳統(tǒng)發(fā)酵類食品如豆豉中也得以越來(lái)越多地應(yīng)用。第二代測(cè)序技術(shù)采用穩(wěn)定的可逆終止法邊合成邊測(cè)序反應(yīng),即生成新DNA互補(bǔ)鏈時(shí),加入的dNTP通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光,或直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP或半簡(jiǎn)并引物,在合成或連接生成互補(bǔ)鏈時(shí)釋放出熒光信號(hào);捕獲的光信號(hào)并轉(zhuǎn)化為一個(gè)測(cè)序峰值,獲得互補(bǔ)鏈序列信息[11]。不僅確保了測(cè)序的高精確性和高順序性,而且排除了由重復(fù)序列和同聚物導(dǎo)致的測(cè)序錯(cuò)誤。如通過(guò)高通量測(cè)序,李曉然等[2]研究了云南地區(qū)豆豉中細(xì)菌群落多樣性,石聰?shù)萚3]對(duì)比湖南瀏陽(yáng)豆豉在不同發(fā)酵階段的微生物多樣性,董蘊(yùn)等[4]對(duì)湖北當(dāng)陽(yáng)細(xì)菌型豆豉細(xì)菌類群進(jìn)行了評(píng)價(jià)。然而,作為經(jīng)典的江西特產(chǎn)中華豆豉,僅有陳廷濤、汪孟娟、楊林等[12-15]近年來(lái)結(jié)合傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)、PCR-DGGE和高通量測(cè)序法對(duì)江西豆豉制曲和發(fā)酵階段的菌群動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了一定的監(jiān)測(cè),而基于高通量測(cè)序的成品微生物群落多樣性分析卻少見(jiàn)報(bào)道。

本研究分別對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及MiSeq高通量測(cè)序,進(jìn)而分析江西特色發(fā)酵豆豉中微生物群落多樣性,從而更準(zhǔn)確、全面地掌握其菌群特征,以了解和提高產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全性,也為后續(xù)豆豉生產(chǎn)的優(yōu)化改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆豉 南昌稻香園調(diào)味食品有限公司,于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;Phusion ? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer NEB(北京)有限公司;高效高保真酶 NEB(北京)有限公司;Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù)試劑盒 NEB(北京)有限公司;GeneJET 膠回收試劑盒 賽默飛世爾科技(北京)有限公司。

5427 R高速冷凍離心機(jī)、Mastercycler X50 PCR擴(kuò)增儀 艾本德中國(guó)有限公司;Miseq高通量測(cè)序儀 Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 gDNA提取 采用CTAB法[2]提取豆豉樣品中所有微生物的gDNA,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓:100 V時(shí)間:40 min)選擇無(wú)明顯降解、無(wú)雜質(zhì),質(zhì)量合格,無(wú)菌水稀釋濃度至1 ng/μL,備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以1.2.1得到的gDNA為模板,選擇Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer及高效高保真酶,采用帶Barcode的特異引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。30 μL PCR體系:2× Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix 15 μL,2 μmol/L Primer 3 μL,1 ng/μL gDNA 10 μL,ddH2O 2 μL。PCR條件:98 ℃ 1 min;98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。引物及序列信息:16S rDNA(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′),ITS1(ITS5-1737F:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′;ITS2-2043R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的混樣及純化 得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,根據(jù)電泳結(jié)果將PCR產(chǎn)物調(diào)節(jié)成等濃度后進(jìn)行混勻,再用GeneJET膠回收試劑盒純化回收[16]。

1.2.4 高通量測(cè)序及α-多樣性分析 由北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)序及物種注釋、豐富度、復(fù)雜度等數(shù)據(jù)分析。采用Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù),經(jīng)定量和檢測(cè)合格后MiSeq測(cè)序。截去Barcode和引物擴(kuò)增序列,FLASH拼接,過(guò)濾、去嵌合體序列,得到有效Tags。Uparse聚類OTUs,細(xì)菌采用Mothur方法與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(閾值設(shè)定0.8～1),真菌采用Qiime Blast方法與Unite_INSDC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋(閾值設(shè)定0.6～1),統(tǒng)計(jì)各分類水平組成?；谖锓N注釋結(jié)果進(jìn)行物種豐富度聚類及α-多樣性分析。以稀釋曲線、chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)評(píng)估α-多樣性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

物種注釋、豐富度等數(shù)據(jù)分析結(jié)果均采用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計(jì)及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

經(jīng)鑒定，gDNA無(wú)明顯降解、無(wú)雜質(zhì),確認(rèn)PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確,樣品合格后進(jìn)行后續(xù)建庫(kù)測(cè)序分析,如圖1所示。豆豉樣品中細(xì)菌及真菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。原始上機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過(guò)濾后,分別得到細(xì)菌31563條及真菌46834條有效序列;以97%的一致性經(jīng)Uparse軟件將有效序列聚類分析,分別得到細(xì)菌OTUs為114個(gè),真菌OTUs為8個(gè)。

表1 豆豉樣品中細(xì)菌及真菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Bacterial and fungal sequencing data statistics in the Douchi

圖1 豆豉樣品中細(xì)菌及真菌PCR結(jié)果Fig.1 PCR result of bacteria and fungi in the Douchi注:M為100 bp ladder,上樣量為2 μL;1為細(xì)菌PCR產(chǎn)物, 2為真菌PCR產(chǎn)物,上樣量均為3 μL。

2.2 物種注釋

豆豉樣品中細(xì)菌物種注釋結(jié)果如圖2所示?？芍刽鶚悠分屑?xì)菌的組成較豐富,以占比58%的Cyanobacteria Chloroplast Unclassified(藍(lán)細(xì)菌門未分類屬)和34%的Firmicutes Bacilli(厚壁菌門芽孢桿菌綱)為主。厚壁菌門芽孢桿菌綱中,94%為Bacillales(芽孢桿菌目)和約6%的Lactobacillales(乳桿菌目)。芽孢桿菌目中以Staphylococcus(葡萄球菌屬)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(99%),約1%為Bacillus(芽胞桿菌屬),以及極少量的Paenibacillus(類芽孢桿菌屬)。尤其值得關(guān)注的是乳桿菌目,分布較為復(fù)雜,主要為L(zhǎng)actobacillaceae(乳桿菌科),含51%的Lactobacillus(乳桿菌屬)和5%的Pediococcus(片球菌屬);其次為Streptococcaceae(鏈球菌科),含12%的Streptococcus(鏈球菌屬)和0.5%的Lactococcus(乳球菌屬);另有12%的Enterococcus(腸球菌屬);以及Leuconostocaceae(明串珠菌科),含7%的Leuconostoc(明串珠菌屬)和5%的Weissella(魏斯氏菌屬);0.2%的Aerococcus(氣球菌屬)。

圖2 豆豉樣品中細(xì)菌的物種注釋結(jié)果Fig.2 Species annotation result of bacteria in the Douchi

豆豉樣品中真菌物種注釋結(jié)果如圖3所示?？芍刽鶚悠分姓婢慕M成極為單一,幾乎全為ZygomycotaLichtheimia(接合菌門橫梗霉屬)。

圖3 豆豉樣品中真菌的物種注釋結(jié)果Fig.3 Species annotation result of fungi in the Douchi

2.3 物種豐富度聚類

根據(jù)物種注釋結(jié)果,統(tǒng)計(jì)豆豉樣品的細(xì)菌、真菌在門分類水平上物種相對(duì)豐度分布,如圖4所示?？芍急茸罡邽镃yanobacteria(藍(lán)細(xì)菌門),達(dá)58%;其次Firmicutes(厚壁菌門),為34%;分列三、四位的Actinobacteria(放線菌門)和Proteobacteria(變形菌門),各約占4%;其余6門均低于總豐度的0.1%。而豆豉樣品的真菌組成中,Zygomycota(接合菌門)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì),比例高達(dá)99.94%,而Ascomycota(子囊菌門)僅為0.06%。

圖4 豆豉樣品在細(xì)菌、真菌門水平上的物種相對(duì)豐度分布Fig.4 Bacterial and fungal relative abundance on the phylum level in the Douchi

2.4 樣品復(fù)雜度(α-多樣性)分析

豆豉樣品內(nèi)細(xì)菌、真菌α-多樣性如圖5、圖6和表2所示。根據(jù)稀釋曲線、Chao1曲線、Shannon曲線結(jié)果可知,隨著測(cè)序量增加細(xì)菌和真菌均趨向平坦,說(shuō)明此次實(shí)驗(yàn)測(cè)序量合理,可涵蓋豆豉樣品中物種總數(shù),反映樣品內(nèi)細(xì)菌、真菌等微生物信息全貌。而且,由表2可知,豆豉樣品中細(xì)菌的物種總數(shù)(102)遠(yuǎn)大于真菌的物種總數(shù)(8)。細(xì)菌的Shannon指數(shù)(2.106)大于真菌的Shannon指數(shù)(0.774),說(shuō)明豆豉樣品中細(xì)菌的群落多樣性較真菌更高。

表2 豆豉樣品中細(xì)菌及真菌α-多樣性指標(biāo)統(tǒng)計(jì)Table 2 Alpha diversity statistics of bacteria and fungi in the Douchi

圖5 豆豉樣品中細(xì)菌α-多樣性分析Fig.5 Alpha diversity analysis of bacteria in the Douchi注：A：稀釋曲線；B：Chaol指數(shù)；C:Shannon指數(shù)；圖6同。

圖6 豆豉樣品中真菌α-多樣性分析Fig.6 Alpha diversity analysis of fungi in the Douchi

3 討論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品以其獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營(yíng)養(yǎng)及優(yōu)越的益生功能等特點(diǎn)被人們廣泛喜愛(ài),在很多地區(qū)已演化成寶貴的代表性文化遺產(chǎn),如紹興黃酒、鎮(zhèn)江香醋、桂林腐乳、江西豆豉、郫縣豆瓣醬、日本清酒、韓國(guó)泡菜、意大利乳酪等?；趥鹘y(tǒng)培養(yǎng)和分子微生態(tài)學(xué)方法,結(jié)合基因組學(xué)技術(shù),愈加證明其地域、風(fēng)味特色與所處環(huán)境的特征微生物的參與密切相關(guān)[17-18]。其中豆豉作為一種我國(guó)特色的藥食兩用發(fā)酵豆制品,擁有復(fù)雜的微生物多樣性及潛在的優(yōu)良發(fā)酵益生菌株資源,近年來(lái)也愈加為科學(xué)工作者所關(guān)注[19-22]。由于多采用傳統(tǒng)工藝開(kāi)放式生產(chǎn),各地區(qū)的環(huán)境氣候、原料工藝、風(fēng)味偏好等差異明顯,豆豉制曲、發(fā)酵過(guò)程中及成品間的微生物種類組成差異極大,從而造就了其極具地方特色的特點(diǎn)。前期已有不少科研工作者采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)云南[2,23-25]、湖南[3,26]、湖北[4]、甘肅[22]等國(guó)內(nèi)各地區(qū)豆豉的微生物多樣性進(jìn)行了分析。然而,作為藥食兩用的地方風(fēng)味特產(chǎn)江西豆豉,其微生物群落多樣性及特征卻較少被關(guān)注。少數(shù)報(bào)道也僅采用了分析能力較局限的傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)和PCR-DGGE法[12-14]。在本研究中,利用MiSeq高通量測(cè)序?qū)鞫刽善分屑?xì)菌、真菌均進(jìn)行了表征,并與國(guó)內(nèi)其他典型地區(qū)進(jìn)行比較。結(jié)果表明,江西豆豉成品中細(xì)菌組成較為豐富,主要以藍(lán)細(xì)菌門未分類屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬為主,含少量的腸球菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬,以及極少量的乳球菌屬、氣球菌屬;而真菌組成較為單一,幾乎全為接合菌門橫梗霉屬;相比傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)和PCR-DGGE結(jié)果顯然分析更為全面準(zhǔn)確,與制曲發(fā)酵階段的菌群組成也有較大差異[1,12-15]。與其他地區(qū)豆豉樣品特征差異明顯,如云南[24,25]、甘肅[22]樣品中假絲酵母屬均為優(yōu)勢(shì)菌群,而江西未檢出;湖南瀏陽(yáng)[3]樣品中雖以橫梗霉屬為主,但真菌組成更為復(fù)雜,同時(shí)存在絲衣霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、毛孢子菌屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬等[4]。而細(xì)菌類別中基本都存在葡萄球菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬;但比例區(qū)別較大,如云南景洪[24]樣品以明串珠菌屬為主,云南普洱[25]樣品以嗜鹽四聯(lián)球菌、湖北當(dāng)陽(yáng)[4]樣品以芽孢桿菌屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。

4 結(jié)論

江西豆豉成品中細(xì)菌組成較為豐富,以藍(lán)細(xì)菌門未分類屬、葡萄球菌屬、乳桿菌屬為主;真菌組成較為單一,大都為接合菌門橫梗霉屬。因此,本研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了環(huán)境對(duì)豆豉中微生物群落多樣性的影響,同時(shí)證實(shí)了江西豆豉具有豐富的微生物群落多樣性及特色的菌群組成結(jié)構(gòu),這為后續(xù)豆豉工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)化改進(jìn)提供理論指導(dǎo),以進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全性;同時(shí)也為深入挖掘具有我國(guó)傳統(tǒng)地方特色的發(fā)酵菌種和基因資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和導(dǎo)向。