乳腺小葉增生篩選方外用對(duì)乳腺增生大鼠乳腺形態(tài)學(xué)及動(dòng)情間期血清E2、P、PRL 的影響

繆 霓，王 群*，王珊珊，貢翊斐，王小平，蔡惠群，張 宇

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，上海 200071；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071）

乳腺增生病是乳房部一種既非炎癥亦非腫瘤的疾病，以經(jīng)前乳房脹痛及不同程度的乳房腫塊為特征，是育齡期女性常見的乳房疾病。目前認(rèn)為，卵巢內(nèi)分泌激素失調(diào)是本病的主要原因。乳腺小葉增生篩選方（淫羊藿、巴戟天、香附、莪術(shù)、柴胡等）是我院臨床應(yīng)用于乳腺增生病的外治經(jīng)驗(yàn)方，臨床效果反映良好。課題組的前期研究表明，應(yīng)用苯甲酸雌二醇序貫黃體酮肌注可以復(fù)制大鼠乳腺增生病模型，外用藥物13天后各組大鼠乳腺腺泡面積和導(dǎo)管內(nèi)徑之間無差異，已呈現(xiàn)復(fù)舊狀態(tài)[1]。據(jù)研究[2]表明，大鼠正常動(dòng)情周期在4～5天左右，課題組考慮去除外源性性激素13天后，大鼠可能已經(jīng)經(jīng)歷了將近3個(gè)正常的動(dòng)情周期。因此，課題組將本次實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間提前，分別在用藥5天、10天取樣，評(píng)價(jià)外用中藥對(duì)模型大鼠動(dòng)情間期性激素水平的影響以及乳頭直徑的影響，為外用中藥應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠60只，雌性未孕，8周齡，體重（160±20）g；上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0006）。于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)14d，自由飲水進(jìn)食，使平均體重達(dá)200g以上。

1.1.2 外用中藥

仙靈脾、巴戟天、柴胡、制香附、莪術(shù)等中藥配方顆粒（由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，批號(hào)170311）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

苯甲酸雌二醇注射液（生產(chǎn)公司：四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20160301）；黃體酮注射液（生產(chǎn)公司：廣州白云山明興至要有限公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

正置光學(xué)顯微鏡；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；攝像鏡頭（EVILEYE手機(jī)微距鏡頭）。

1.2 隨機(jī)分組

將60只大鼠稱重后，由輕至重編號(hào)，再通過隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、用藥組，每組各20只。

1.3 造模方法

模型組及用藥組參考黃月玲等[3]的研究建立模型，具體方法：予大鼠后肢外側(cè)肌肉注射苯甲酸雌二醇(劑量為0.5 mg/kg/d)連續(xù)20天序貫黃體酮（5 mg/kg/d）連續(xù)5天，共25天復(fù)制模型。對(duì)照組每日在后肢外側(cè)肌肉注射0.9%生理鹽水0.2 ml，連續(xù)25d。各組大鼠從實(shí)驗(yàn)開始每日觀察大鼠陰道涂片，記錄動(dòng)情期變化。

1.4 干預(yù)方法

大鼠外用藥物劑量按照成人70 kg每日所服藥量換算，根據(jù)大鼠體重計(jì)算出當(dāng)日藥量，電子天平稱取每日所需總劑量，加蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚝笮纬绅こ頎钏幒?，等分后涂抹?×1 cm紗布上，覆蓋在大鼠第三對(duì)乳房上。淀粉糊精貼敷劑制作及使用方法同上。從干預(yù)治療周期開始用藥，對(duì)照組及模型組給予淀粉糊精貼敷，用藥組給予藥糊貼敷，每次上藥后用自制縛帶將大鼠第三對(duì)乳房纏繞，每日貼敷8小時(shí)以上，連續(xù)10天；大鼠單籠飼養(yǎng)，防止相互啃咬。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 乳頭直徑

分別于造模前后及給藥5d、10d后，使用手機(jī)微距鏡頭，等距離微距拍攝，以1cm軟尺作為參照物，軟件測量大鼠第三對(duì)乳頭直徑，并觀察乳房外觀。

1.5.2 血清性激素水平影響

分別于造模前后及給藥5d、10d，通過陰道涂片觀察大鼠動(dòng)情間期，于監(jiān)測到的每一個(gè)動(dòng)情間期內(nèi)眥靜脈取血，酶聯(lián)免疫檢測大鼠E2、P、PRL。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。大鼠乳頭直徑及血清性激素水平數(shù)據(jù)均用“s”表示，服從正態(tài)分布及方差齊性時(shí)采用方差分析，不服從正態(tài)分布或方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠造模前后及給藥后乳頭直徑比較

表1 各組大鼠造模前后及用藥后乳頭直徑比較

表1 各組大鼠造模前后及用藥后乳頭直徑比較

注：與對(duì)照組相比，1）P＞0.05，2）P＜0.05；與模型組相比，3）P＜0.05；*指大鼠在造模過程中死亡2只。

組別造模前 造模后 用藥5天后 用藥10天后n直徑（mm） n 直徑（mm） 直徑（mm） 直徑（mm）對(duì)照組 20 0.89±0.05 20 1.13±0.05 1.10±0.06 1.07±0.06模型組 20 0.86±0.061) 20 1.24±0.072) 1.22±0.052) 1.13±0.072)用藥組 20 0.87±0.051) 18* 1.21±0.082) 1.12±0.052)3) 1.01±0.021)3)

2.2 各組大鼠造模前后及給藥后E2、P、PRL變化

表2 各組大鼠造模前后及給藥后E2、P、PRL水平比較（E2 ：Pmmol/L、P：ng/mL、PRL：ng/mL）（x±s）

3 討 論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的外治理論及經(jīng)驗(yàn)豐富，清代吳尚先《理瀹駢文》[5]記載了大量廣泛應(yīng)用于臨床的外用方劑，且提出：“外治之理即內(nèi)治之理，外治之藥亦即內(nèi)治之藥，所異者法耳。醫(yī)理藥性無二，而法則神奇變幻。”“病先從皮毛入，藥即可由此進(jìn)?！标U明了外治與內(nèi)治療效相當(dāng)，只要辨證正確，外用藥通過皮膚的吸收，能達(dá)到內(nèi)服藥物同樣的療效。本次實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)陸德銘教授對(duì)乳腺增生病“沖任失調(diào)，氣滯血瘀互為因果”病機(jī)的認(rèn)識(shí)[6]，課題組采用巴戟天、淫羊藿補(bǔ)腎調(diào)沖，柴胡、香附、莪術(shù)疏肝活血，同時(shí)現(xiàn)代藥理研究證實(shí)[7]，補(bǔ)腎藥物可以使下丘腦－垂體－卵巢軸間的功能得以改善，有調(diào)節(jié)失調(diào)的性激素的作用。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，乳頭直徑的變化是評(píng)價(jià)乳腺增生病模型及治療作用的一項(xiàng)公認(rèn)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)造模成功后，大鼠乳頭直徑增大，在撤除外源性激素10天后，模型組大鼠的乳頭直徑未見明顯縮??；而用藥組大鼠的乳頭直徑已縮小至正常狀態(tài)，這說明外用中藥貼敷能夠加速乳頭直徑的恢復(fù)時(shí)間，并推測是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的雌激素所起到的效果。提示我們對(duì)于乳腺增生病的治療應(yīng)從調(diào)節(jié)血清性激素水平著手。

綜上，乳腺小葉增生篩選方外用有很大優(yōu)勢，既能在藥效上發(fā)揮作用，在便利性上又有別于中藥湯藥需要煎煮、花費(fèi)較多時(shí)間的特點(diǎn)，外用中藥不受時(shí)間地點(diǎn)限制，可行性強(qiáng)。因此，外用小葉增生篩選方給患者提供了一種多的治療方式。