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    大氣壓冷等離子體對(duì)大鼠凝血功能的影響

    2019-03-28 01:27:44張克英陳啟亮芮剛武霄錚郭玲張俊平劉志強(qiáng)李和平丁桂榮
    關(guān)鍵詞:抗凝血等離子體距離

    張克英 ,陳啟亮 ,芮剛 ,武霄錚 ,郭玲 ,張俊平 ,劉志強(qiáng) ,李和平 ,丁桂榮

    1.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系輻射防護(hù)醫(yī)學(xué)教研室,陜西西安710032;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院三大隊(duì)二中隊(duì),陜西西安710032;3.中國(guó)人民解放軍78506部隊(duì),四川成都610000;4.華北理工大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院,河北唐山063210;5.清華大學(xué)工程物理系,北京100084;6.特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安710032

    前言

    等離子體通常是一種離子化的氣體狀物質(zhì),被認(rèn)為是獨(dú)立于固、液、氣之外的物質(zhì)第四態(tài),按照粒子的溫度可將等離子體分為兩大類(lèi),熱平衡等離子體(或熱等離子體)和非熱平衡等離子體(或冷等離子體)[1]。其中,熱等離子體具有較高的能量密度,粒子溫度可達(dá)10 000-20 000 K的數(shù)量級(jí),故被廣泛用于銅、鋁、鈦、鎳等金屬材料的高溫熔煉[2],非金屬材料的熱熔化和納米材料的制備等;而冷等離子體則被用于材料表面改性、清潔活化、高效滅菌和加速化學(xué)反應(yīng)等。

    出血作為最常見(jiàn)的創(chuàng)傷表現(xiàn)形式,是創(chuàng)傷早期患者死亡的主要原因之一[3]。內(nèi)臟出血、腔道出血等隱匿性出血,目前多采用介入手術(shù)栓塞血管、出血點(diǎn)套扎等方式,手術(shù)難度較大。既往研究顯示,熱等離子體可以通過(guò)熱效應(yīng)使蛋白變性和血液干燥從而達(dá)到凝血的目的[4],但熱等離子體在發(fā)揮凝血作用的同時(shí)可引發(fā)出血部位的灼痛感,甚至造成周?chē)M織的燒傷和傷口的延遲愈合[5]。據(jù)報(bào)道,大氣壓冷等離子體(Cold Atmospheric Plasma,CAP)可以加速血液凝固并促進(jìn)傷口愈合,且不會(huì)對(duì)周?chē)M織造成損傷,該研究結(jié)果為出血性疾病治療提供了新的方法和思路[6-7]。本研究從體外血滴實(shí)驗(yàn)不同參數(shù)CAP對(duì)凝血效果的影響以及動(dòng)物出血模型兩個(gè)方面展開(kāi)CAP促凝血現(xiàn)象的驗(yàn)證,并通過(guò)抗凝血滴對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    清潔級(jí)成年雄性SD大鼠22只,體質(zhì)量(250±20)g,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=11)和CAP處理組(n=11)。動(dòng)物飼養(yǎng)在22~24℃的恒溫環(huán)境中,濕度保持在40%~70%,保證12 h/d的光照并避免噪音,飼養(yǎng)期間所有動(dòng)物可自由攝取水和食物。所有實(shí)驗(yàn)均獲得第四軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 CAP裝置

    本實(shí)驗(yàn)采用的CAP裝置由清華大學(xué)工程物理系研制,該裝置以氦氣作為氣體源,采用介質(zhì)阻擋放電方式產(chǎn)生CAP射流,其中含有OH、N2、He、O、NO、N2+等活性離子。

    1.3 血滴實(shí)驗(yàn)

    大鼠用1%戊巴比妥鈉(0.45 mg/kg)腹腔注射麻醉,在距大鼠尾部末端約2 mm處剪斷其尾巴,然后立即用無(wú)菌離心管收集血液并吸取100μL血液滴于載玻片中央。將制備好的血滴玻片隨機(jī)分為Control組(n=3)和CAP處理組(n=3)。CAP處理組立即采用不同作用距離(1、2、3 cm),不同放電電壓(3.33、6.73、8.03 kV)和不同作用時(shí)間(30、60、120 s)的CAP處理血滴。Control組暴露于空氣中不做任何處理。血液滴于玻片5 min時(shí)采集血滴圖片,分析血滴凝固效果。

    1.4 出血模型實(shí)驗(yàn)

    1.4.1 尾部出血模型將大鼠按照上述方法麻醉,在距大鼠尾部末端約5 mm處剪斷尾巴建立此出血模型[8],之后立即采用正常血滴實(shí)驗(yàn)篩選的CAP最佳凝血參數(shù)(放電電壓8.03 kV、照射時(shí)間120 s、照射距離1 cm)處理出血部位,通過(guò)記錄出血時(shí)間和出血量(濾紙吸收血液后濕重-濾紙干重)評(píng)價(jià)CAP的凝血效果[9]。Control組暴露于空氣中不做任何處理。

    1.4.2 腳趾出血模型在距大鼠左前足最外側(cè)腳趾末端約1 mm處剪斷腳趾建立此出血模型。之后,采用與尾部出血模型相同的CAP參數(shù)研究其對(duì)大鼠腳趾出血的干預(yù)效果。

    1.4.3 股靜脈出血模型將大鼠仰臥位固定于無(wú)菌操作臺(tái)上,剔除大鼠左側(cè)腹股溝毛發(fā),碘伏消毒皮膚后暴露并分離股靜脈,用6號(hào)針頭45°穿刺股靜脈,建立股靜脈出血模型[10]。采用與尾部出血模型相同的方式觀(guān)察CAP對(duì)大鼠股靜脈出血的干預(yù)效果。

    1.5 抗凝血滴實(shí)驗(yàn)

    將大鼠用1%戊巴比妥鈉(0.45 mg/kg)腹腔注射麻醉,之后做“U型”皮膚切口,剪斷肋骨并充分暴露心臟,利用無(wú)菌注射器于左心室抽取6 mL血液,并用枸櫞酸鈉對(duì)抽取的血液作抗凝處理。吸取抗凝血100μL滴于載玻片中央,采用放電電壓8.03 kV、處理時(shí)間120 s和作用距離為1 cm的CAP處理血滴。Control組暴露于空氣中不做任何處理。血液滴于玻片5 min時(shí)采集血滴圖片,并分析血滴凝固效果。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,出血時(shí)間、出血量采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,P<0.05認(rèn)為結(jié)果有顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 CAP促進(jìn)血滴凝固的距離效應(yīng)

    不同CAP作用距離結(jié)果顯示,Control組血滴表面形態(tài)未發(fā)生明顯變化(圖1a)。與對(duì)照組相比,當(dāng)放電電壓為8.03 kV,處理時(shí)間為120 s,作用距離為1 cm時(shí),CAP處理組血滴表面變得干燥且有殼樣物形成,其表面可見(jiàn)酒窩樣凹陷(圖1b);當(dāng)放電電壓和處理時(shí)間不變,作用距離增加至2 cm時(shí),CAP組血滴表面干燥程度顯著降低,凹陷數(shù)量明顯減少(圖1c);當(dāng)作用距離增加至3 cm時(shí),可見(jiàn)CAP組僅血滴周?chē)休p度凝固,血滴表面未見(jiàn)明顯凹陷(圖1d)。上述結(jié)果提示,CAP具有明顯促進(jìn)血滴凝固的作用,并且與CAP作用距離呈負(fù)相關(guān)。

    圖1 CAP促進(jìn)正常血滴凝固的距離效應(yīng)Fig.1 Effect of treatment distance of cold atmospheric plasma(CAP)on blood coagulation

    2.2 CAP促進(jìn)血滴凝固的時(shí)間效應(yīng)

    Control組血滴暴露于空氣中5 min后其表面形態(tài)幾乎沒(méi)有變化,中央?yún)^(qū)依然光滑透亮(圖2a)。與對(duì)照組相比,當(dāng)放電電壓為8.03 kV,作用距離為1 cm,處理時(shí)間為30 s時(shí),CAP處理組的血滴表面變得干燥,可見(jiàn)細(xì)小的殼樣物與酒窩樣凹陷(圖2b);當(dāng)放電電壓和作用距離不變,作用時(shí)間延長(zhǎng)至60 s時(shí),CAP處理組的血滴表面干燥程度顯著增加,血滴表面凹陷數(shù)量明顯增多、凹陷面積明顯增大(圖2c);當(dāng)放電電壓和作用距離不變,作用時(shí)間增加至120 s時(shí),可見(jiàn)CAP組血滴表面大部分區(qū)域變成殼樣物,凹陷數(shù)量進(jìn)一步增多(圖2d)。上述結(jié)果提示,CAP具有明顯的促進(jìn)血滴凝固作用,并且隨著CAP作用時(shí)間呈正相關(guān)。

    圖2 CAP促進(jìn)血滴凝固的時(shí)間效應(yīng)Fig.2 Effects of treatment duration of CAP on blood coagulation

    2.3 CAP促進(jìn)血滴凝固的電壓效應(yīng)

    Control組血滴暴露于空氣中5 min后血滴形態(tài)幾乎沒(méi)有變化,中央?yún)^(qū)光滑透亮(圖3a)。與Control組相比,當(dāng)CAP處理時(shí)間為120 s,作用距離為1 cm,放電電壓為3.33 kV時(shí),CAP組血滴邊緣變得干燥且有凹陷形成,血滴中央依然光滑透亮(圖3b);當(dāng)CAP作用時(shí)間和作用距離不變,放電電壓增加為6.73 kV時(shí),CAP組血滴大部分區(qū)域變得干燥形成殼樣物,血滴表面出現(xiàn)許較多細(xì)小凹陷,血滴中央仍可見(jiàn)小范圍光滑透亮區(qū)(圖3c);當(dāng)作用時(shí)間和作用距離保持不變,放電電壓增加為8.03 kV時(shí),CAP組血滴表面殼樣物范圍增大,表面凹陷增多(圖3d)。上述結(jié)果提示,CAP可顯著促進(jìn)血滴凝固,并且與CAP放電電壓呈正相關(guān)。

    2.4 CAP對(duì)大鼠不同部位出血的凝血效果

    與Control組相比,CAP組大鼠尾部、腳趾、股靜脈的出血時(shí)間和出血量均顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖4。上述結(jié)果提示,CAP可以加速動(dòng)物不同部位出血的凝血過(guò)程。

    2.5 CAP對(duì)抗凝血滴的凝固作用

    在觀(guān)察時(shí)間內(nèi),Control組血滴形態(tài)幾乎沒(méi)有變化(圖5a)。與Control組相比,CAP組血滴表面變得干燥、血滴表面酒窩樣凹陷明顯增多(圖5b)。上述結(jié)果提示,CAP可以明顯促進(jìn)枸櫞酸鈉抗凝血滴的凝固。

    圖3 CAP促進(jìn)血滴凝固的電壓效應(yīng)Fig.3 Effect of discharge voltages of CAP on blood coagulation

    圖4 CAP對(duì)大鼠不同部位出血的凝血效果Fig.4 Coagulation effect of CAP in rat models with different bleeding sites

    圖5 CAP對(duì)抗凝血滴的凝固作用Fig.5 Effect of CAP on anticoagulant blood

    3 討論

    本論文研究所采用的CAP射流是外加電場(chǎng)電離稀有氣體后產(chǎn)生的含有大量帶電粒子、活性自由基、激發(fā)態(tài)中性粒子及光子等的第四類(lèi)物質(zhì)狀態(tài),其中的活性成分具有誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡[11]、調(diào)節(jié)細(xì)胞聚集粘附與增殖[12]、加速化學(xué)反應(yīng)[13]等功能。既往實(shí)驗(yàn)室研究顯示,CAP可以促進(jìn)血液樣本快速凝固,其機(jī)制可能與CAP中的氧自由基加速凝血化學(xué)反應(yīng)有關(guān)[14]。另?yè)?jù)報(bào)道,與傳統(tǒng)電凝止血相比,低溫等離子體對(duì)腺樣體肥大手術(shù)中的出血具有良好止血效果[6]。Fridman等[5]也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象,即CAP可以顯著促進(jìn)脾臟切口的血液凝固,且不產(chǎn)生明顯的組織損傷。

    本研究為了篩選和探討常壓冷等離子體對(duì)血液凝固的影響并篩選其最佳參數(shù),初步探討其作用機(jī)制,首先觀(guān)察了CAP對(duì)血滴凝固的影響。結(jié)果顯示,CAP可以明顯促進(jìn)血滴凝固,主要表現(xiàn)為血滴表面殼樣物和酒窩樣凹陷形成以及干燥程度增加[15]。并且,CAP促凝血作用與CAP的處理時(shí)間、作用距離和放電電壓密切相關(guān),該結(jié)果與Kuo等[15]的研究結(jié)果一致。進(jìn)而,筆者采用血滴實(shí)驗(yàn)篩選確定的CAP最佳凝血參數(shù),觀(guān)察CAP對(duì)大鼠不同部位出血的促凝效果,發(fā)現(xiàn)與Control組相比CAP組大鼠尾部、腳趾和股靜脈的出血時(shí)間明顯縮短,出血量明顯降低,提示CAP對(duì)體外血滴具有明顯的促凝作用,對(duì)動(dòng)物不同部位出血也具有明顯的凝血作用,該結(jié)果與Fridman[5]和 Kalghatgi[7]的研究結(jié)果一致。

    隨后筆者利用CAP處理枸櫞酸鈉抗凝的血滴,結(jié)果顯示,CAP可以明顯促進(jìn)抗凝血滴凝固。已有研究表明,枸櫞酸根離子可與血中的Ca2+相結(jié)合,形成不易離解的可溶性絡(luò)合物,通過(guò)降低血液中Ca2+濃度,抑制凝血。既往認(rèn)為,等離子體可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)提高血液中Ca2+濃度,進(jìn)而促進(jìn)血液凝固[16]。然而,最新研究顯示,等離子體處理血液后,其pH值與Ca2+濃度均無(wú)顯著變化,提示CAP促進(jìn)血液凝固,特別是枸櫞酸鈉抗凝血液凝固可能不是通過(guò)增加Ca2+濃度發(fā)揮作用[7]。考慮到Ca2+參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的凝血酶原激活物形成和凝血酶形成過(guò)程,但不參與纖維蛋白形成,筆者認(rèn)為,CAP可能主要是通過(guò)促進(jìn)纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化而加速凝血過(guò)程。該推測(cè)與既往報(bào)道一致,即Kalghatgi等[7]利用等離子體處理人工合成的纖維蛋白原溶液后,溶液逐漸渾濁,提示等離子體可以啟動(dòng)纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)化。

    綜上所述,我們認(rèn)為CAP可以加速血液凝固并增強(qiáng)其凝血效果,該過(guò)程可能與CAP促進(jìn)纖維蛋白原向?yàn)槔w維蛋白轉(zhuǎn)化有關(guān)。

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