城步峒茶資源主要生化成分遺傳多樣性分析

寧 靜，劉 振，楊擁軍，楊 陽*，沈程文，張曙光*，肖敦旺，馬良元

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院 茶學(xué)系，湖南長沙 410128；3.城步縣農(nóng)業(yè)局，湖南 城步 422500；4.城步天仁大峒茶業(yè)有限公司，湖南 城步 422500）

茶樹[Camellia sinensis(L.) O.Kuntze]種質(zhì)資源是茶樹種質(zhì)創(chuàng)新、品種選育、生產(chǎn)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)，合理選用優(yōu)良種質(zhì)是提高育種成效的技術(shù)關(guān)鍵之一[1]。城步峒茶原產(chǎn)于湖南省城步縣境內(nèi)，是湖南四大典型地方茶樹群體資源之一。陳興琰等[2]、陳國本[3]、石林[4]認(rèn)為，城步峒茶是茶樹由原始喬木型向灌木栽培型馴化的重要見證，是湖南四大茶樹地方群體資源中與云南大葉種親緣關(guān)系最近的類型。張貽禮和胡萬選[5]、黎星輝等[6]研究認(rèn)為，峒茶屬南方型大葉茶樹，適制紅碎茶，內(nèi)質(zhì)優(yōu)異，風(fēng)格獨(dú)特。袁春華等[7]對(duì)城步峒茶植株、樹型、樹姿、葉片和花器官等形態(tài)特征進(jìn)行研究，認(rèn)為城步峒茶產(chǎn)地可能是茶樹原產(chǎn)地的“尾聲”區(qū)域。因此，收集、保存、鑒定、評(píng)價(jià)和開發(fā)利用城步峒茶種質(zhì)資源對(duì)于湖南茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

茶樹鮮葉中的生化成分組成及含量決定了茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣以及名優(yōu)茶的適制性，從而決定了茶樹品種資源的利用價(jià)值和開發(fā)效益[8-10]?？梢姡瑢?duì)茶葉品質(zhì)成分進(jìn)行測定分析是研究茶樹品種資源特性、篩選優(yōu)異茶樹資源和對(duì)資源進(jìn)行開發(fā)利用的基礎(chǔ)。而目前對(duì)城步峒茶資源主要生化成分的多樣性分析尚未見研究報(bào)道。本試驗(yàn)以17份有代表性的城步峒茶單株為研究對(duì)象，在同一生境下進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，分析研究其主要生化成分的遺傳多樣性，并從中發(fā)掘出一些特異資源，為深入研究與利用城步峒茶資源提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以城步縣境內(nèi)城步峒茶群體種質(zhì)資源為研究對(duì)象，經(jīng)現(xiàn)場考察后根據(jù)形態(tài)差異收集17份有代表性單株（表1），其中青葉峒茶10份，黃葉峒茶7份。

1.2 測定方法

參照陳亮等[11]編寫的《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》的方法，在春季采摘第1 輪新梢的一芽二葉制作生化樣，用于生化成分測定。水浸出物含量測定參照GB/T 8305-2013；茶多酚含量測定參照GB/T 8313-2008；氨基酸總量測定參照GB/ T8314-2013；咖啡堿含量測定參照GB/T 8312-2013；兒茶素單體測定采用液相色譜法。

表1 17份城步峒茶資源的基本情況Table 1 Basic data of 17 Chenbu Dong Tea plant germplasms

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

基本統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和生化成分多樣性指數(shù)分析采用Excel 進(jìn)行，主成分分析和聚類分析通過 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。主成分分析采用Factor 過程的 Varimax (方差最大化正交旋轉(zhuǎn))，對(duì)各變量進(jìn)行方差最大化正交旋轉(zhuǎn)，提取累計(jì)貢獻(xiàn)率大于85% 的主成分[12]。聚類分析采用離差平方和法（Ward′s method），平均歐氏距離。多樣性指數(shù)的計(jì)算采用 Shannon-Weave 信息指數(shù)[13]，即（H′）=-∑PilnPi，其中Pi為某性狀第i個(gè)代碼出現(xiàn)的頻率。計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)（H′）前先對(duì)數(shù)量性狀進(jìn)行質(zhì)量化處理，對(duì)數(shù)值性狀進(jìn)行10 級(jí)分類：1 級(jí)＜-2s，10 級(jí)≥+2 s，中間每級(jí)差 0.5 s，為平均數(shù)，s 為標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要生化成分表現(xiàn)和遺傳多樣性分析

由表2 可以看出，17份城步峒茶資源的生化成分平均遺傳多樣性指數(shù)（H'）為2.34，變化范圍為1.63%～2.78%，表現(xiàn)出豐富的生化多樣性。15個(gè)指標(biāo)中，遺傳多樣性指數(shù)最大的是EC，達(dá) 2.78，說明EC 含量在城步峒茶種質(zhì)中多樣性較廣泛，所包含的信息量較大；其次為咖啡堿和EGCG 含量，分別為2.72 和2.65；最小為水浸出物含量，僅為1.63。

變異系數(shù)是衡量各觀測值變異程度的一個(gè)統(tǒng)計(jì)量[14]。在影響茶葉品質(zhì)的4 項(xiàng)常規(guī)生化成分（水浸出物、氨基酸、茶多酚、咖啡堿）中，變異系數(shù)最大的是咖啡堿，達(dá)20.04%；其次是氨基酸和酚氨比，分別為17.48%和17.18 %；最小的是水浸出物，僅為3.27%，說明這4個(gè)成分中，咖啡堿和氨基酸的改良潛力較大，而水浸出物的改良潛力最小。水浸出物含量最高的是HD1806（43.64%），最低的是QD1808（40.98%），平均為40.98%；82.35%的資源水浸出物含量超過40%，說明城步峒茶內(nèi)含物質(zhì)豐富。茶多酚含量最高的是QD1807（35.10%），最低的是QD1801（27.62%），平均為31.14%，茶多酚含量＞30%的單株11個(gè)，占資源的64.71%，其中＞35%的單株2個(gè)：QD1807（35.10%）和HD1802（35.05%），可篩選為高茶多酚資源。氨基酸含量最高的是QD1803（4.00%），最低的是QD1801（2.18%），平均為3.07%，47.06%的資源氨基酸含量低于3%?？Х葔A含量最高的是HD1804（5.74%），最低的是HD1807（2.39%），平均為4.14%，咖啡堿含量＞4.00%的單株有11個(gè)，占資源的64.71%，屬于較高咖啡堿茶樹資源，其中＞5.00%的單株有兩個(gè)：QD1810（5.11%）和HD1804（5.74%），為高咖啡堿茶樹資源。

酚氨比是一個(gè)體現(xiàn)茶樹資源適制性的生化指標(biāo)，酚氨比小于8，一般適制綠茶，酚氨比在8～15 之間為紅綠茶兼制型，酚氨比大于15，一般適制紅茶[15]。城步峒茶資源酚氨比變幅為7.67%～13.43%，平均為10.28%，以HD1803 最高，QD1803 最低。其中只有1份資源的酚氨比小于8，其余資源的酚氨比均在8～15 之間，具有紅綠茶兼制特性，占資源的94.1%。

兒茶素是茶葉保健功能的主要成分，其含量和組成與茶葉品質(zhì)密切相關(guān)，也是體現(xiàn)茶樹資源進(jìn)化類型的一個(gè)重要指標(biāo)[16]。由表2 可以看出，17份城步峒茶資源的兒茶素組分含量整體變異系數(shù)較大，資源變異類型較多，在育種上的選擇范圍大。非酯型兒茶素的變異系數(shù)高于酯型兒茶素，變異系數(shù)最大的是EGC 的含量，達(dá)到 52.23 %，其次是 EC 和 C，而且在體現(xiàn)茶樹進(jìn)化程度的EC 和C 占整個(gè)兒茶素的比例上，城步峒茶資源也包含豐富的類型，高的達(dá)到10.54 %，低的僅為2.33 %，存在豐富的變異(CV=30.48 %)，說明城步峒茶資源在進(jìn)化程度上存在豐富的多樣性，既具有比較原始的類型，也有進(jìn)化程度較高的類型。17份資源中，兒茶素總量＞17%有1份（HD1802），酯型兒茶素＞12%的資源有2份（QD1807 和HD1806）。

表2 主要生化成分的基本統(tǒng)計(jì)參數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Basic statistical parameters and genetic diversity index of main biochemical composition

2.2 生化成分的主成分分析

主成分分析能夠較好地解釋群體方差的主要來源，從而獲得解釋方差的重要性狀并簡化研究性狀，以利于更好地研究群體[17]。以 17份資源15個(gè)生化成分為變量，以累積貢獻(xiàn)率≥85%為標(biāo)準(zhǔn)，確定了 4個(gè)主成分（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前4個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)85.20%，這4個(gè)主成分包含了所有性狀的大部分信息，可以用來對(duì)材料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[18]。第1 主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到29.76%，貢獻(xiàn)最大的是酯型兒茶素和EGCG，其次是茶多酚和兒茶素總量，反映的主要是酯型兒茶素含量的信息；第 2主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到29.29%，貢獻(xiàn)最大的是非酯型兒茶素，其次是GC 和EGC，反映的主要是非酯型兒茶素含量的信息。第3 主成分貢獻(xiàn)率達(dá)到15.18%，貢獻(xiàn)最大的是負(fù)值的氨基酸含量，其次是酚氨比，反映的主要是酚氨比的信息；第4 主成分貢獻(xiàn)最大的是C，其次是GCG。

2.3 城步峒茶資源的聚類分析

根據(jù)15個(gè)生化成分?jǐn)?shù)據(jù)，將17份城步峒茶資源進(jìn)行聚類分析（圖1），同時(shí)根據(jù)聚類的結(jié)果比較分析了各類群生化成分的差異（表4）。

由圖1可知，當(dāng)在遺傳距離為10 時(shí)，可以將17份城步峒茶資源聚為3個(gè)類群。其中有8份峒茶資源聚到第Ⅰ類群中，并分為2個(gè)亞群：QD1810、HD1804、QD1807、QD1803、QD1804 和QD1802為一個(gè)亞群；HD1802 和HD1806 為一個(gè)亞群。第Ⅱ類群包括5份峒茶資源：QD1805、HD1801、QD1808、QD1809 和HD1807。第Ⅲ類群包括4份峒茶資源：QD1801、HD1805、QD1806 和HD1803。

由表4可知，三個(gè)類群除了水浸出物含量不存在顯著差異外，其他各生化成分均有顯著的差異。第Ⅰ類群的水浸出物、茶多酚和氨基酸含量是三個(gè)類群中最高的，酚氨比10 左右，屬紅綠茶兼制型；第Ⅱ類群茶多酚含量較高，氨基酸含量較高，酚氨比9 左右，也是紅綠茶兼制的資源；第Ⅲ類群的茶多酚含量較高，氨基酸含量較低，酚氨比大于12，是適制紅茶的資源。從總體上看，三個(gè)類群的資源茶多酚含量（＞29%）都較高，氨基酸含量＜4%，酚氨比均大于8，說明城步峒茶大部分資源適制紅茶。

圖1 城步峒茶資源的聚類分析Fig.1 Dendrogram of 17 Chenbu Dong Tea germplasm resources

2.4 特異種質(zhì)資源的篩選

在茶葉深加工中功能性成分的提取和高含量功能性成分茶產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，生化成分含量特異的茶樹種質(zhì)往往是其生產(chǎn)的重要原料來源，同時(shí)該類種質(zhì)可以作為雜交育種的親本用于今后育種的研究[19]。本研究根據(jù)生化成分測定結(jié)果，參照《農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評(píng)價(jià)規(guī)范-茶樹》（NY/T 2031-2011）相關(guān)指標(biāo)及有關(guān)文獻(xiàn)，從17份城步峒茶資源中初步篩選出21份生化成分特異的種質(zhì)，還有一批潛在的優(yōu)良資源，詳見表5。這些特異資源可以作為育種親本用于今后的育種研究或者直接利用。

表5 生化成分含量特異的資源Table 5 Some special germplasms on biochemical compositions

3 討論

通過對(duì)篩選的17份資源進(jìn)行系統(tǒng)鑒定評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)城步峒茶資源的主要生化成分存在較高的遺傳多樣性，平均多樣性指數(shù)達(dá)到2.34。變異類型比較豐富，在很多成分上變異系數(shù)較高，有很大的選擇潛力。另一方面，從本研究結(jié)果可以看出，城步峒茶資源既有進(jìn)化上比較原始的類型（EC 和C 的比例較高），也有進(jìn)化程度較高的類型（酯型兒茶素比例高），這可能與城步苗族自治縣與廣西壯族自治區(qū)龍勝縣接壤，而桂西北地區(qū)屬于西南茶區(qū)，毗鄰茶樹的起源中心，在自然環(huán)境上與其相似，可能是茶樹的次生中心之一[20]，在茶樹資源的分布上，蘊(yùn)藏著一些進(jìn)化程度較低的類型，而其他地方的資源則在進(jìn)化程度上較高，所以在生化成分的分布上表型比較豐富。

15個(gè)生化成分變量表現(xiàn)出連續(xù)性變異，變異幅度和變異系數(shù)均較大，平均變異系數(shù)達(dá)24.43 %，比相鄰近的廣西(25.80 %)[21]、四川(26.80 %)[22]偏低，而比云南(16.53 %)[23]偏高。在17份資源中，水浸出物、茶多酚、氨基酸和咖啡堿含量的平均值分別為 40.98%、31.14%、3.07%和 4.14%。與廣西、四川、云南茶樹資源茶多酚含量、咖啡堿含量相比偏高。本研究中，水浸出物含量最高達(dá)43.64%，最低為37.67%，有82.35 %的資源超過40%，說明城步峒茶內(nèi)含物質(zhì)豐富；茶多酚含量最高為35.10%，最低為27.62%，有64.71%的資源大于30%，屬于高茶多酚資源；氨基酸含量最高為4%，最低為2.18%，有47.06%的資源低于3%；咖啡堿含量最高為5.74%，最低為2.39%，有64.71%的資源大于4%，屬于高咖啡堿資源。楊亞軍[9]、陸錦時(shí)等[24]的研究結(jié)果認(rèn)為，適制紅茶的品種氨基酸含量相對(duì)較低，茶多酚、兒茶素、水浸出物和咖啡堿含量較高，酚氨比高。根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，城步峒茶大部分資源適制紅茶。

表4 不同類群的主要生化成分比較Table 4 Comparision of main biochemical components of different groups

根據(jù) 17份資源 15個(gè)生化成分變量分析，前4個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)85.197%，保留了15個(gè)生化成分的信息。其生化因子對(duì)品質(zhì)的貢獻(xiàn)依次為：酯型兒茶素構(gòu)成因子＞非酯型兒茶素構(gòu)成因子＞酚氨比構(gòu)成因子。第 1 主成分中貢獻(xiàn)率最大的為酯型兒茶素（0.912）和EGCG（0.889），表明在所分析的15個(gè)生化成分中酯型兒茶素和EGCG 對(duì)茶葉品質(zhì)的影響較大。從各主成分對(duì)品質(zhì)育種有價(jià)值的入選材料應(yīng)是第1主成分因子適中偏大，第 2、第3 主成分適中，第4 主成分適中偏小。

聚類分析將17份資源劃分為三大類群，每個(gè)類群的生化成分存在較大差異，決定了適制性不同。酚氨比是判定茶樹資源適制性的一個(gè)指標(biāo)，一般認(rèn)為酚氨比小于8 適制綠茶，大于15 適制紅茶。而新標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313-2008 測得，茶葉茶多酚含量比 GB/T 8313-2002 標(biāo)準(zhǔn)降低了30%～40%[25-27]；本研究認(rèn)為，采用 2008 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測茶多酚和氨基酸以楊亞軍等[28]認(rèn)為酚氨比小于7 適制綠茶，大于10 適制紅茶較為實(shí)際。因此，在此次17份資源中，按照此數(shù)值進(jìn)行比較，適制綠茶資源只有1份，紅綠茶兼制型資源7份，適制紅茶資源9份。依據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，第Ⅰ、Ⅱ類群為紅綠茶兼制型，第Ⅲ類群則為適制紅茶型。分類結(jié)果與實(shí)際結(jié)果大致相符。

通過系統(tǒng)的鑒定評(píng)價(jià)，初步篩選出一批生化成分優(yōu)異的資源。17份資源的茶多酚含量均≥25%，屬高茶多酚特異資源；選出咖啡堿含量大于4%的潛在優(yōu)異資源11份，其中QD1810和HD1804 為咖啡堿≥5%的特異資源；選出兒茶素含量大于17%的資源1份：HD1802，酯型兒茶素大于12%的資源2份：QD1807 和HD1806。這些資源在某一成分或幾個(gè)成分上（如QD1807、HD1802 和QD1810 等）具有較高的含量，對(duì)這些優(yōu)異資源進(jìn)行深入研究，可以在深加工上直接利用或?yàn)榻窈蟛铇潆s交育種提供新的親本材料。