液相色譜-質譜聯(lián)用測定果葡糖漿中葡萄糖、果糖含量

毛燕琴，劉敬，陳積紅，3，胡偉，王曙陽，李文建，3

(1.中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學院大學生命科學學院，北京 100049；3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室，甘肅 武威 733001)

果葡糖漿亦稱高果糖漿(high fructose syrup)或異構糖漿，是以酶法糖化淀粉所得的糖化液經葡萄糖異構酶的異構作用，將其中一部分葡萄糖異構成果糖，由葡萄糖和果糖組成的一種混合糖漿[1-2].果葡糖漿甜度與蔗糖相近，且具有冷甜性、滲透壓大、易于吸收、抗結晶性強、溶解度高、抗齲齒性、保濕性好等優(yōu)良特性，被廣泛應用到醫(yī)療保健行業(yè)與食品工業(yè)中[3-6].在果葡糖漿生產過程中，葡萄糖、果糖含量的變化是生產過程的重要參數(shù)指標，因此快速準確測定其含量變化具有重要的實際意義.

目前，糖類物質的檢測方法有滴定法、容量法、色譜分析法[7-8]、比色法[9]、旋光法[10].如翟建云等利用分光光度法測定毛竹快速生長期莖稈不同節(jié)間果糖、葡萄糖的變化[11]，姚令文等用超高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器法測定生脈注射液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量[12].根據(jù)我國檢測食品單糖和二糖的國標GB 5009.8-2016[13]規(guī)定，果糖、葡萄糖、蔗糖的檢出限為0.2%.高效液相色譜法很容易達到這樣的檢測指標，但在實驗研究中，經常需要實時檢測衡量的單糖、二糖含量.這時就需要更靈敏的檢測器.

質譜檢測器相對于其他檢測器具有更高的靈敏度，且對樣品純度的要求更低，減少了工作量和分析時間[14].液相色譜-質譜聯(lián)用技術結合質譜鑒別力強的特點和液相色譜分離度高的優(yōu)勢，具有高通量、靈敏度高、準確性強、操作簡單等特點，是配備質譜的實驗室可選用的最佳檢測技術[15].現(xiàn)在已有利用超高壓液相色譜-質譜連用檢測葡萄糖、果糖及低聚糖的報道[16-17].但是鑒于單糖極性弱的缺點，在具體檢測過程中需要在流動相中加入甲酸銨以提高檢測精確度，現(xiàn)有文獻對甲酸銨濃度對液質聯(lián)用檢測果糖、葡萄糖的影響尚無具體報道.本研究擬建立超高壓液相色譜-質譜聯(lián)用測定果葡糖漿中葡萄糖、果糖含量的實驗方法.通過優(yōu)化質譜條件(碰撞能量)，優(yōu)化目標物的檢出限；通過優(yōu)化色譜條件(梯度洗脫程序、流動相的比例、甲酸銨濃度)，實現(xiàn)葡萄糖、果糖在色譜柱中的良好分離；以期建立一種準確、靈敏、快速的檢測方法，為果葡糖漿生產過程中的質量控制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜高粱果葡糖漿(甘肅省輻照誘變育種工程實驗室提供)、葡萄糖、果糖標準品(純物質)、甲酸銨(純度≥99.0%)購自美國Sigma公司、乙腈(色譜純)購自美國Fisher公司；水(高純水)，購自屈臣氏.

1.2 儀器與設備

進樣瓶(2 mL)，甘肅海智色譜技術有限公司；聚偏二氟乙烯針頭過濾器(13 mm，0.22 μm)，甘肅海智色譜技術有限公司；BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，美國Waters公司；TE101-L天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Qube超高壓液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜工作站，BRUKER.

1.3 試驗方法

1.3.1 質譜條件的選擇 分別用75%乙腈配制濃度分別為3.9、13 μg/mL葡萄糖、果糖的單標溶液，采用直接進樣方式分別注入HESI離子源中，進樣量為1 μL，流速為200 μL/min，噴霧電壓(+)為4 000 V，噴霧電壓(-)為3 500 V，加熱探針溫度為400 ℃，錐體溫度為350 ℃，在負離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到葡萄糖、果糖的分子離子，再以每種糖的準分子離子峰為母離子，進行二級質譜掃描，采集全掃描的二級質譜圖，根據(jù)碎片離子信息，選擇2種糖的最佳質譜參數(shù).

1.3.2 色譜條件的選擇 色譜柱：BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：室溫；進樣量：1 μL；柱壓：75 bar；流速：200 μL/min；流動相：A相為甲酸銨水溶液，B相為乙腈.梯度洗脫程序見表1.

表1 梯度洗脫程序

1.3.2.1 流動相比例對檢測結果的影響 以A相20 mmol/L甲酸銨水溶液，B相乙腈為流動相，乙腈與水的比例分別為75∶25，85∶15，觀察所得到的色譜圖，選擇最適的流動相比例.樣品采用葡萄糖濃度為0.756 8 μg/mL、果糖濃度為0.801 9 μg/mL的混合標準溶液，進樣量為1 μL，流速為200 μL/min.

1.3.2.2 甲酸銨濃度對檢測結果的影響 A相的甲酸銨濃度分別設計為5 mmol/L，20 mmol/L，40 mmol/L，檢測不同甲酸銨濃度對葡萄糖和果糖色譜結果的影響.樣品采用葡萄糖濃度為0.756 8 μg/mL、果糖濃度為0.801 9 μg/mL的混合標準溶液，流動相乙腈與水的比例為75∶25(V/V)，進樣量為1 μL，流速為200 μL/min.

1.3.3 標準溶液的配制

1.3.3.1 標準貯備液的配制 分別準確稱取390、1 300 μg葡萄糖、果糖標準品，用75%乙腈溶液定容至1 mL，即390 μg/mL葡萄糖標準貯備液、1 300 μg/mL果糖標準貯備液.

1.3.3.2 標準工作液的配制 用1.3.3.1配制的標準貯備液分別依次配制葡萄糖質量濃度分別為1.56、3.12、3.9、7.8、31.2 μg/mL、果糖質量濃度分別為6.5、13、16.25、32.5、130 μg/mL的各系列標準混合溶液.

1.3.4 樣品處理 向甜高粱果葡糖漿樣品中添加3%活性炭，80 ℃攪拌中水浴0.5 h后，在轉速4 000 r/min條件下離心5 min，取上清液后在硅藻土助濾取上清液.吸取100 μL上清液于裝有900 μL 75%乙腈溶液的離心管中，渦旋混合均勻后即成10-1稀釋液，再按上述步驟依次稀釋到10-2、10-3稀釋液，渦旋混合均勻后用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液作為供試樣品溶液，備用.

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

糖分分析用負離子模式質譜響應可達105級，而正離子模式響應差[14]，因此本實驗采用負離子掃描方式.采用直接進樣方式分別將葡萄糖、果糖單標溶液注入HESI離子源中，在負離子檢測方式下進行母離子全掃描，得到葡萄糖、果糖的分子離子分別為179.1、179.1.分別以葡萄糖179.1、果糖179.1分子離子峰為母離子，進行二級質譜掃描，得到碎片離子信息，然后再對二級質譜參數(shù)如碰撞能量等進行優(yōu)化，使每種糖的定性離子與定量離子產生的離子對強度比例達到最大時為最佳，從而得到每種糖的最佳質譜參數(shù)(表2).

表2 葡萄糖、果糖的質譜分析條件參數(shù)

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相比例對檢測結果的影響 按照不同流動相比例檢測樣品得到的色譜圖如圖1～2.從圖1～2可以看出，流動相乙腈與水的比例為75∶25條件下，在各峰的分離度較好的前提下保留時間也較短，所以選擇流動相乙腈與水的比例為75∶25進行樣品的檢測.因為出峰時間較短，所以本試驗的洗脫程序為先通過等度洗脫分離出果糖和葡萄糖，再進行梯度洗脫清除殘留樣品，最后恢復到進下一個樣品的AB相比例.葡萄糖和果糖為同分異構體，不易分離，流動相中乙腈比例及其變化對化合物的保留有較大的影響，進而影響分離度及分離選擇性[18-19]，適當增加流動相中乙腈含量有助于葡萄糖、果糖的分離[16]，本試驗結果與已有報道符合.

圖1 樣品色譜圖(乙腈∶水=85∶15)Figure 1 The chromatogram of sample(acetonitrile∶water=85∶15)

圖2 樣品色譜圖(乙腈∶水=75∶25)Figure 2 The chromatogram of sample (acetonitrile∶water = 75∶25)

2.2.2 甲酸銨濃度對檢測結果的影響 本試驗嘗試在流動相A相中加入甲酸銨，并研究不同濃度的甲酸銨對檢測結果的影響，添加不同濃度甲酸銨檢測樣品得到的色譜圖見圖3～5.從圖3～5可以看出，甲酸銨濃度對檢測結果有顯著影響，濃度過大或過小，都不能得到較好的峰形.A相用20 mmol/L的甲酸銨水溶液既能保證流動相基質不干擾測定結果，也有效增強待測物質的檢出信號，達到了預期效果.流動相條件的選擇主要考慮被分析物的分離、檢測的靈敏度和色譜峰形.有文獻報道流動相中加入緩沖鹽可以降低固定相與帶電荷溶質之間的靜電作用，調節(jié)峰形及物質的保留，不加緩沖鹽時易造成峰拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)[18].也有文獻報道[20]甲酸作為一種改性劑在一定程度上可以增強質譜響應，而且可以有效地改善色譜峰拖尾的現(xiàn)象.試驗結果與已有報道符合.

圖3 樣品色譜圖(甲酸銨濃度：5 mmol/L)Figure 3 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate：5mmol/L)

圖4 樣品色譜圖(甲酸銨濃度：20 mmol/L)Figure 4 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate:20 mmol/L)

圖5 樣品色譜圖(甲酸銨濃度：40 mmol/L)Figure 5 The chromatogram of sample (the concentration of ammonium formate:40 mmol/L)

2.2.3 工作曲線與檢出限 將1.3.3.2配制的各系列標準混合溶液在進樣量為1 μL，柱壓為75 bar，流速為200 μL/min，流動相：A相為20 mmol/L甲酸銨水溶液，B相為乙腈，且乙腈與水的比例為75∶25的條件下進行液質聯(lián)用上機分析，以化合物的峰面積為縱坐標(Y)、對應的質量濃度為橫坐標(X，μg/mL)繪制標準曲線，按3倍RSN計算檢出限.結果表明，本方法在一定的濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(R2)均大于0.99(表3)，檢出限明顯低于高效液相色譜法.

2.2.4 樣品檢測 將不同酶解條件的甜高粱果葡糖漿按上述1.3.4方法進行前處理，在進樣量為1 μL，柱壓為75 bar，流速為200 μL/min，流動相：A相為20 mmol/L甲酸銨水溶液，B相為乙腈，且乙腈與水的比例為75∶25的條件下進行液質聯(lián)用上機分析.另外用分光光度法檢測所有樣品中葡萄糖、果糖含量.經配對t檢驗，P≥0.05，2種方法檢測結果無顯著性差別，結果見表4.

表3 葡萄糖、果糖的標準曲線方程、相關系數(shù)、線性范圍和檢出限

表4 樣品中葡萄糖和果糖含量檢測結果

3 討論

流動相條件的選擇主要考慮被分析物的分離、色譜峰形和檢測的靈敏度。葡萄糖和果糖為同分異構體，液相色譜不易分離。在液相色譜模式中通常以高比例有機溶劑(常為乙腈)為流動相[18]，通過逐漸增大水的比例調節(jié)流動相的極性，依次洗脫出極性不同的溶質。該色譜模式中，化合物的保留隨其極性的增大而增強，流動相中有機相的含量是控制分離的主要因素。并發(fā)現(xiàn)，流動相中乙腈比例及其變化對化合物保留的影響較大，進而影響分離選擇性及分離度[19]，適當增加流動相中乙腈含量有助于果糖、葡萄糖的分離[16]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，采用水-乙腈(25∶75，V/V)時，可以較好地分離樣品中果糖、葡萄糖，且保留時間也較短。單糖極性較弱，需要在流動相A相中加入一些易揮發(fā)鹽的緩沖液來提高檢測精確度，如甲酸銨、乙酸銨，也可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等。通過實驗發(fā)現(xiàn)，流動相A相用20 mmol/L的甲酸銨水溶液，在保證流動相基質不影響檢測結果的前提下，增強了待測物質的檢出信號。

果葡糖漿中果糖、葡萄糖含量較高，用75%乙腈多倍稀釋后可有效減小基質效應，因此樣品需采用75%乙腈依次稀釋1 000倍后用0.22 μm微孔濾膜過濾后才可進樣分析。

采用高效液相色譜法對糖類分析，檢測器可以采用示差檢測器，蒸發(fā)光檢測器，紫外檢測器。紫外檢測法測定響應值低，準確度差；示差折光檢測法受溫度等外界條件影響較大，方法穩(wěn)定性差、基線噪聲大[21]。本文建立的液相色譜-質譜聯(lián)用檢測法，作為一種通用型檢測器，對溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，靈敏度高。

4 結論

本試驗建立了液相色譜-質譜聯(lián)用法測定果葡糖漿中葡萄糖、果糖含量的測定方法。利用性能可靠的BEH Amide色譜柱，參照本方法，在10 min內即可完成果葡糖漿中的糖成分的定量分析，相較于其他檢測方法，縮短了分析時間，并且檢出限低(葡萄糖0.32 μg/mL，果糖0.74 μg/mL)，靈敏度高，是測定葡萄糖和果糖含量的一個精確方法。新建立的方法操作簡便、分析速度快、靈敏度高，更適用于分析果葡糖漿中的糖的組分。