頂空固相微萃取與液液萃取竹葉青露酒中揮發(fā)性物質(zhì)成分的比較

張默雷，王曉聞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中030801）

竹葉青酒是一種著名的中國傳統(tǒng)露酒。其釀造是以山西汾酒為基酒，保留了竹葉的風(fēng)味特色，通過添加紫檀、零香、廣木香、陳皮、公丁香、砂仁、當(dāng)歸等十余種藥材，浸提而成的一種露酒，該酒具有補(bǔ)益肝胃、活血補(bǔ)血、順氣消食、促進(jìn)血液循環(huán)等功效[1]。酒體色澤金黃、透明略帶綠色。竹葉青酒具有汾酒的醇香，同時(shí)還兼具中藥的香氣[2-4]。前期對于竹葉青酒的相關(guān)研究大多停留在竹葉青酒的保健功能上，對于揮發(fā)性物質(zhì)的研究較為有限。

頂空固相微萃取法是將萃取頭垂直置于待測樣品上方的氣相中，吸附揮發(fā)性組分[5]。該方法適用于微量揮發(fā)性物質(zhì)聚集，可減少底物樣品中的其他物質(zhì)干擾，且便于操作。液液萃取法是利用相似相融原理用溶劑分離或提取液體混合物中組分的前處理方法[6-8]。范文來等利用頂空固相微萃取-氣相色譜法從白酒中檢測萜烯化合物[9]。袁仲等采用液液萃取法（liquidliquid extraction，LLE），應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)分析國產(chǎn)食醋的香味物質(zhì)[10]。萃取前處理與氣質(zhì)聯(lián)用是近年來新興的方法，適用于對揮發(fā)性物質(zhì)檢測的相關(guān)研究[11]。

本研究主要對比了固相微萃取法和液液萃取法兩種不同的前處理方式，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法對不同年份的竹葉青酒進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)測定，通過對比檢測物質(zhì)的種類、含量等因素，從固相微萃取和液液萃取兩種方法中篩選出最佳的前處理手段，用于進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山西省汾陽市杏花村汾酒廠生產(chǎn)的一年竹葉青酒（45度），五年竹葉青酒（38度）。

氯化鈉、戊烷-乙醚混合萃取劑（1∶3，體積比）：分析純，北京索萊寶科技有限公司。

ISQ TRACE 1300氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱OM-5MS[30 m×0.25 mm（ID）×0.25 μm]、多功能樣品前處理平臺萃取裝置及多功能自動(dòng)進(jìn)樣器TriPlus RSH、2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭：美國賽默飛世爾科技公司；HH-W4恒溫水浴鍋：上海赫田科學(xué)儀器有限公司。

1.2 測定方法

1.2.1 頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）

取竹葉青酒樣10 mL于頂空瓶，加入氯化鈉5 g，封蓋搖勻，在恒溫水浴鍋中加熱，在一定溫度下平衡15 min，再將已經(jīng)活化好的萃取頭插入前處理好的酒樣瓶中，在25℃下萃取樣品50 min，萃取完成后，萃取頭于氣相色譜進(jìn)樣口250℃解吸5 min，以上過程重復(fù)3次，再進(jìn)行GC-MS分析[13-14]，質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)NIST質(zhì)譜庫檢索。

1.2.2 液液萃取

將15 mL待測酒樣稀釋到酒精度15%vol，取稀釋后酒樣于樣品瓶中，加入氯化鈉直至過飽和，取溶液加入45 mL戊烷-乙醚混合萃取劑，振蕩萃取1 min靜置，分層后吸取有機(jī)相再進(jìn)行多級萃取，以此類推，反復(fù)3次，再進(jìn)行GC-MS分析[15-17]，質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)NIST質(zhì)譜庫檢索。

1.3 GC-MS條件

色譜條件：載氣He，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫采用程序升溫，初始溫度：40℃保持1 min，以4℃/min升至80℃，保留1 min，再以2℃/min升至170℃，保持1 min，最后以10℃/min升至260℃，保留5 min，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：質(zhì)譜傳輸線280℃，離子源溫度為280℃，掃描范圍 45amu～550amu，電離方式為 EI源[12]。

1.4 樣品分組

本試驗(yàn)將樣品分為4組：HS-SPME前處理法的五年酒樣標(biāo)記為H5；LLE前處理法的五年酒樣標(biāo)記為L5；HS-SPME前處理法的一年酒樣標(biāo)記為H1；LLE前處理法的一年酒樣標(biāo)記為L1。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME、LLE不同前處理五年竹葉青酒檢測結(jié)果對比（H5、L5）

H5樣品經(jīng)GC-MS檢測，竹葉青酒中揮發(fā)性香味物質(zhì)的成分總離子流圖見圖1，對應(yīng)物質(zhì)的成分分析表見表1。

表1選取了頂空固相微萃取法前處理的五年竹葉青酒經(jīng)GC-MS檢測，通過NIST質(zhì)譜庫檢索得出的29種物質(zhì)。其中酯類11種，占總成分的27.05%；醇類6種，占總成分的41.53%；其他類合計(jì)12種，占總成分的31.42%（包括酮類3種，占總成分的1.31%；烷類3種，占總成分的5.3%；醛類2種，占總成分的0.31%，其他類4種，占總成分的24.5%）。

L5樣品經(jīng)GC-MS檢測，竹葉青酒中揮發(fā)性香味物質(zhì)的成分總離子流圖見圖2，對應(yīng)物質(zhì)的成分分析表見表2。

表2選取了液液萃取法前處理的五年竹葉青酒經(jīng)GC-MS檢測，通過NIST質(zhì)譜庫檢索得出的18種物質(zhì)。其中酯類8種，占總成分的25.88%；醇類4種，占總成分的41.03%，41.53%；其他類合計(jì)6種，占總成分的33.09%（包括酮類2種，占總成分的0.31%；烷類2種，占總成分的5.54%；其他類2種，占總成分的27.24%）。

圖1 H5樣品竹葉青酒揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 H5 total ion flow diagram of volatile components in bamboo leaf green wine

表1 H5樣品竹葉青酒揮發(fā)性物質(zhì)成分表Table 1 H5 composition of volatile substances in bamboo leaf green wine

圖2 L5樣品竹葉青酒揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 L5 total ion flow diagram of volatile components in bamboo leaf green wine

表2 L5樣品竹葉青酒揮發(fā)性物質(zhì)成分表Table 2 L5 composition of volatile substances in bamboo leaf green wine

2.2 HS-SPME、LLE不同前處理一年竹葉青酒的檢測結(jié)果對比（H1、L1）

H1樣品經(jīng)GC-MS檢測，竹葉青酒中揮發(fā)性香味物質(zhì)的成分總離子流圖見圖3，對應(yīng)物質(zhì)的成分分析表見表3。

表3選取了頂空固相微萃取法前處理的一年竹葉青酒經(jīng)GC-MS檢測，通過NIST質(zhì)譜庫檢索得出的28種物質(zhì)。其中酯類13種，占總成分的27.29%；醇類4種，占總成分的40.98%；其他類合計(jì)11種，占總成分的31.73%（包括烯類6種，占總成分的4.65%；烷類2種，占總成分的5.59%；其他類3種，占總成分的21.49%）。

L1樣品經(jīng)GC-MS檢測，竹葉青酒中揮發(fā)性香味物質(zhì)的成分總離子流圖見圖4，對應(yīng)物質(zhì)的成分分析表見表4。

圖3 H1樣品竹葉青酒揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.3 H1 total ion flow diagram of volatile components in bamboo leaf green wine

表3 H1樣品竹葉青酒揮發(fā)性物質(zhì)成分表Table 3 H1 composition of volatile substances in bamboo leaf green wine

表4選取了液液萃取法前處理的一年竹葉青酒經(jīng)GC-MS檢測，通過NIST質(zhì)譜庫檢索得出的15種物質(zhì)。其中酯類6種，占總成分的23.33%；醇類3種，占總成分的40.91%；其他類合計(jì)6種，占總成分的35.76%（包括烯類3種，占總成分的3.53%；烷類1種，占總成分的5.43%；其他類2種，占總成分的26.8%）。

圖4 L1樣品竹葉青酒揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.4 L1 total ion flow diagram of volatile components in bamboo leaf green wine

表4 L1樣品竹葉青酒揮發(fā)性物質(zhì)成分表Table 4 L1 composition of volatile substances in bamboo leaf green wine

根據(jù)對比圖譜及表1～表4顯示：

H5被檢測出的物質(zhì)種類及數(shù)量多于L5，H1被檢測出的物質(zhì)種類及數(shù)量多于L1。

對比兩種前處理方法，對于五年竹葉青酒樣，HSSPME和LLE兩種前處理方法共同檢測出了乙酸乙酯、甲酸異戊酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、異戊醇、S-（-）-2-甲基-1-丁醇、正己醇、甲乙酮、二乙氧基甲烷、N-丁基硝酰胺、二乙氧基乙烷、4-羥基-2-丁酮等16種揮發(fā)性物質(zhì)；經(jīng)HS-SPME前處理的酒樣，單獨(dú)檢測出了乙酸異戊酯、DL-白氨酸乙酯、乙酸龍腦酯、丙醇、正戊醇、2-茨醇、樟腦、正己醛、壬醛、乙酸銨、1，1-二乙氧基-3-甲基-丁烷、5-氨基頡草酸、S-（-）-檸檬烯等 13種揮發(fā)性物質(zhì)；經(jīng)LLE前處理的酒樣，單獨(dú)檢測出了異丁醇、2-正戊基呋喃等2種揮發(fā)性物質(zhì)。

對于一年竹葉青酒樣，HS-SPME和LLE兩種前處理方法共同檢測出了乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、甲酸異戊酯、丙醇、異戊醇、S-（-）-2-甲基-1-丁醇、萜品油烯、β-石竹烯、N-丁基硝酰胺、二乙氧基乙烷、丁醛二乙縮醛、S-（-）-檸檬烯15種揮發(fā)性物質(zhì)；經(jīng)HS-SPME前處理的酒樣，單獨(dú)檢測出了正己酸乙酯、DL-白氨酸乙酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯、左旋乙酸冰片酯、甲酸異丁酯、苯甲酸異戊酯、1，3-二氧雜烷-2-甲醇、蒎烯、月桂烯、左旋樟腦、α-律草烯、1，1-二乙氧基-3-甲基-丁烷13種揮發(fā)性物質(zhì)；經(jīng)LLE前處理的酒樣，未單獨(dú)檢測出異于HS-SPME前處理酒樣所檢測出的物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用頂空固相微萃取法、液液萃取法分別處理竹葉青酒樣，不同的前處理方法是造成GC-MS檢測結(jié)果出現(xiàn)差異的主要原因。GC-MS是測定揮發(fā)性物質(zhì)的有效方法，而酒類樣品屬于水相樣品[13-15]，對其進(jìn)行前處理就成為了GC-MS檢測物質(zhì)種類和多少的關(guān)鍵。頂空固相微萃取法是利用固體吸附原理將液相中的目標(biāo)物質(zhì)吸附于其中，通過洗脫使得目標(biāo)化合物富集[16-18]，提高了酒樣中的化合物被GC-MS檢測到的可能，更便于試驗(yàn)研究與檢測。而傳統(tǒng)的液液萃取法中目標(biāo)化合物與萃取劑的互溶性各不相同，溶解在萃取劑中的物質(zhì)含量很有限，相比頂空固相微萃取法所檢測出的物質(zhì)會有部分缺失[19-20]，因此在對比圖譜和表1～表4后發(fā)現(xiàn)，一年竹葉青酒和五年竹葉青酒，經(jīng)頂空固相微萃取法前處理后所檢測出的物質(zhì)數(shù)量與種類明顯多于液液萃取法的處理檢測結(jié)果。根據(jù)對比，五年竹葉青酒中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)總體上HSSPME比LLE多11種，酯類多3種，醇類多2種其他類多6種；HS-SPME和LLE前處理的酒樣檢測出共同擁有的物質(zhì)有16種，而HS-SPME單獨(dú)檢測出獨(dú)有的揮發(fā)性物質(zhì)13種，LLE單獨(dú)檢測出獨(dú)有的物質(zhì)僅2種。一年竹葉青酒中檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)總體上HS-SPME比LLE多13種，酯類多7種，醇類多3種其他類多5種；HS-SPME和LLE前處理的酒樣檢測出共同擁有的物質(zhì)有15種，而HS-SPME單獨(dú)檢測出獨(dú)有的揮發(fā)性物質(zhì)13種，LLE單獨(dú)檢測出獨(dú)有的物質(zhì)為0種。

頂空固相微萃取法作為萃取液相樣品的前處理方法，具有高效可靠、無毒無害、節(jié)省溶劑耗材等優(yōu)勢，易與GC-MS聯(lián)用，檢測揮發(fā)性有機(jī)物的效果較好，便于定量研究。對于同一種竹葉青酒樣，頂空固相微萃取法處理后的酒樣所檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)種類和數(shù)量更多，并且可以檢測出更多用液液萃取法前處理所不能呈現(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)。因此，在竹葉青酒GC-MS的檢測試驗(yàn)中，樣品的前處理更適合采用頂空固相微萃取法。