Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金作為骨內固定材料在大鼠骨質疏松性骨折愈合中的研究

王戰(zhàn)會，李亞偉，劉少朋，張兵兵，鄭秋霞，谷留平

骨質疏松性骨折是一種常見的疾病，其內固定治療的材料主要有生物醫(yī)用高分子材料、生物醫(yī)用無機非金屬材料及生物醫(yī)用金屬材料。在金屬材料中，目前以鎂合金應用較多，但其自身的彈性模量遠高于骨組織的彈性模量，在應力屏蔽的基礎上易引發(fā)再骨折[1]。再者，鎂合金在體內腐蝕速率快，易引發(fā)應力腐蝕斷裂(stress corrosion cracking, SCC)[2]，嚴重影響其應用范圍。而添加其他金屬可有效改善其特性，Zn、Ca便是其中常用元素[3-4]。此外，在鎂合金表面添加涂層也可延緩其降解速率，殼聚糖即是其中之一，它不僅可增加鎂合金可塑性，還具有抗菌性[10]?；诖?，在總結已有研究成果的基礎上，本研究通過制備含有殼聚糖涂層的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，并研究其在大鼠體內的生物相容性等特點，以期尋找一種更加符合骨折臨床應用的可降解材料。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料試樣制備及研究：Mg、Zn、Zr、Gd、Ca元素(河南科技大學材料學院)；真空熔煉電阻爐(ZG-10，株洲鼎鑫電熱設備有限公司)；Quanta 200型掃描電鏡(西門子)；X線C臂機(飛利浦)；鎂離子檢測試劑盒(WAK-Mg，南京建成生物工程研究所)；鈣離子檢測試劑盒(K380-250-1，南京建成生物工程)；肝功能生化檢測試劑盒(上海透景生命科技股份有限公司)；腎功能生化檢測試劑盒(7170瓶型，上海透景生命科技股份有限公司)。動物實驗材料：成年雌性大白鼠(西安迪樂普公司)。

1.2方法

1.2.1殼聚糖鎂鈣合金的制備采用真空熔煉電阻爐制備Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金。①針對不同比例設定不同燒損量，配置成實驗所需Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，在氬氣保護下置入鎢坩堝中充分溶解，480 ℃保溫20 min，用石墨棒攪拌使金屬元素充分混合；此后精煉、扒渣并靜置處理，在真空熔煉電阻爐中將420 ℃的鎂合金溶液澆筑到預熱200 ℃的鐵坩堝中，靜置30 min后脫模，獲得鑄造態(tài)試樣。②將試室溫2 h內升至300 ℃，恒溫保持3 h；再緩慢升溫2 h至510 ℃保溫20 h，隨后60 ℃熱水淬火。③人工時效處理：將所得固溶體從室溫加熱至150 ℃，保溫26 h，隨爐冷卻。④殼聚糖涂層制備：80%磷酸預處理合金表面2 min，自然晾干；將脫乙酰度90%，分子量為3×105的殼聚糖溶解于1%醋酸溶液中，制備成質量分數(shù)為1%的殼聚糖醋酸溶液，將100 μL殼聚糖醋酸溶液均勻涂抹于處理過的鎂合金正反兩面；將其放入60 ℃烘箱中干燥30 min。⑤切割、拋光：祛除試樣表面氧化層，將其切割成1.0 cm×0.5 cm×3.0 cm大??；先水磨砂紙粗磨，再采用金剛石拋光膏行機械拋光，直至試樣表面無粗磨痕跡，再在鹿皮上進行精拋，制成所需成品。

1.2.2實驗動物分組取27只健康成年雌性大白鼠，體質量(0.3±0.1) kg，同等條件下[恒溫(23±0.5) ℃，恒濕45%～50%]飼養(yǎng)4周后分別切除卵巢，建立骨質疏松模型。待恢復良好后隨機等分為普通鎂鈣合金組(A組)、殼聚糖涂層鎂鈣合金組(B組)、假手術組(C組)，每組各9只。

1.2.3手術方法使用戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)經耳緣靜脈實施麻醉，取右股骨中段手術區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪無菌單，依次切開皮膚、皮下組織、筋膜，分離肌肉組織，暴露股骨，醫(yī)用電鉆于股骨表面鉆孔后于兩孔間制作10 mm×2 mm骨缺損，模擬骨折斷面，將合金試樣置于骨缺損間，并固定良好，見圖1。其中假手術組僅制造骨折斷面，未放置合金材料，空白對照組未做特殊處理。術畢，過氧化氫及無菌生理鹽水沖洗術野并逐層縫合。

圖1 術中固定合金試樣

1.2.4術后處理措施及觀察指標標簽分別注明手術時間、合金類型。術后動物自由活動，分籠常規(guī)飼養(yǎng)。術后1周連續(xù)肌注慶大霉素每日40萬U，預防感染。分別于術后7、14、21 d分批(每次3只)隨機處死各組大鼠并取出合金組織，以備后續(xù)研究。觀察各組大鼠術后精神狀態(tài)，活動、飲食狀況、傷口愈合情況。對所取材料行掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察了解合金降解情況。術后不同時間化驗各組鼠肝功能(谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶)；腎功能血清尿素氮(serum urea nitrogen,BUN)；肌酐(creatinine,Cre)；尿酸了解合金的生物學毒性，并檢測血清中鎂離子、鈣離子濃度。

2 結果

2.1術后一般情況各組大鼠術后生命體征平穩(wěn)，精神狀態(tài)、進食狀況未受明顯影響。A、B組大鼠術后肢體活動正常，C組大鼠術后右下肢功能短期內受明顯影響。觀察期內均未發(fā)生切口感染、皮下氣腫，亦無死亡事件發(fā)生。

2.2術后掃描電鏡觀察SEM檢測示，術后7 d時，A組試樣表面片狀腐蝕明顯，局部腐蝕產物脫落，B組植入物表面可見腐蝕產物聚集，但整體完整。術后14 d時，A組試樣腐蝕進一步加重，且不均勻，表面凸凹不平，結構缺損明顯，可見大量裂紋產生，但B組試樣表面僅見少量淺裂紋，且結構完整。術后21 d時，A組試樣結構破壞明顯，裂紋加深且寬大，而B組試樣表面裂紋雖有增多，但仍較A組明顯偏少，且整體結構完好，見圖2。

2.3生物學毒性檢測

2.3.1手術前后各組大鼠血清鎂離子、鈣離子濃度變化情況術前1 d A、B、C組大鼠血清鎂離子濃度

分別為(1.23±0.23) mol·L-1、(1.19±0.51) mol·L-1、(1.22±0.10) mol·L-1、(1.18±0.47) mol·L-1。術后A、B組2周內鎂離子濃度增高，且以A組變化更明顯，兩組均在3周時降至正常，但術前、術后各時間點鎂離子變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各組間差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。鈣離子濃度變化與此類似，見圖3。

A組：普通鎂鈣合金組；B組：殼聚糖涂層鎂鈣合金組。圖2 術后不同時間兩組合金試樣表面腐蝕情況(SEM，×200)

圖3 手術前后不同時間各組大鼠血清鎂離子、鈣離子濃度變化(n=27)

2.3.2手術前后各組鼠外周血肝、腎功能變化情況術后A、B、C組轉氨酶較前稍升高，此后逐漸降至正常，但術前、術后各時間點肝功能各指標變化組內差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各組間差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。腎功能各指標變化亦如此，見圖4。

3 討論

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種由多因素作用的疾病，其病機尚未完全明確，但由其引發(fā)的骨折卻極大地危害著人體健康。近年來，不斷完善的骨折內固定材料廣泛應用于骨折治療，但部分骨折內固定材料因生物相容性差、力學性能欠佳、排斥反應大等缺陷，而使其適用性受限[5-6]。此后，更多學者嘗試不斷完善鎂合金的相關研究，將Al、Mn等多種元素加入其中，并取得一定效果，但仍不能完全避免其降解速率快、體內產氣多的缺陷[7-8]。目前有報道試圖通過在鎂合金表面添加涂層的方法延緩其降解速率，而殼聚糖便是其中之一[9]。殼聚糖是目前發(fā)現(xiàn)的唯一堿性氨基多糖，其結構經過一定修飾后可得到具有良好抗菌性、生物相容性、可塑性及無毒性特點的材料，進而被應用于骨折內固定[10]。基于以上因素，并結合國內外相關研究，作者制作出含有殼聚糖涂層的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，并探究其在動物體內的生物相容性，以期為后續(xù)研究提供一定參考。

本研究中，各組鼠術后恢復順利，未出現(xiàn)切口感染、皮下氣腫等相關并發(fā)癥，植入物與鼠體內組織保持良好相容性，這與Kim的報道類似[11]。Seitz等[12]研究發(fā)現(xiàn)，未添加涂層的普通鎂鈣合金在體內降解速率快而難以在骨折內固定中達到良好效果。本研究中術后7 d時，A組合金表面出現(xiàn)明顯的片狀腐蝕區(qū)，局部腐蝕產物脫落，而B組整體結構完整。術后14 d時，A組試樣腐蝕進一步加重，且不均勻，表面凸凹不平，結構缺損明顯，可見大量裂紋產生，但B組合金因含有殼聚糖涂層，降解速率較慢，僅見少量裂紋，且深度較淺。至術后21 d時，A組試樣結構破壞明顯，裂紋寬大且深，但B組仍保持較為完整的結構。這提示殼聚糖鎂鈣合金較普通鎂鈣合金降解速率慢，更接近骨折愈合過程，顯示出良好的生物相容性。兩組相比較，術后相同時間內，普通鎂鈣合金表面由點腐蝕較快變?yōu)槊娓g，腐蝕速率顯著高于殼聚糖涂層組，作者預測殼聚糖涂層在降解過程中可能起到了保護膜作用，進而延緩了鎂鈣合金的降解[13]。

在關于生物學毒性的檢測中，術后各組鼠不同時間雖然轉氨酶都有不同程度的增高，但均在可控范圍，且隨著術后時間的延長，各組鼠轉氨酶均逐漸降至正常范圍，未對術后鼠的恢復造成明顯影響。手術前后各組鼠肝功能各項指標變化均無統(tǒng)計學意義，腎功能指標變化情況與肝功能相類似，這與姜冬梅的研究結果一致[14]。在離子濃度檢測中，術后雖然A、B組血清鎂、鈣離子在2周內有所升高，且以A組變化明顯，但各組鼠均為輕微升高，此后均逐漸降至正常，并未出現(xiàn)高血鎂或高血鈣等并發(fā)癥，說明鎂、鈣離子濃度的變化均在實驗鼠可承受范圍內，并未對鼠的術后恢復造成明顯影響。這提示鎂鈣合金的降解是安全的，降解后產生的鎂、鈣離子可及時被機體代謝，初步展現(xiàn)出良好的生物相容性，這與目前已有研究結果相一致[15-18]。此外，手術前后各組鼠血清鎂離子變化無統(tǒng)計學意義，結合本研究中術后掃描電鏡的研究結果，雖然普通鎂鈣合金相較于殼聚糖涂層的鎂鈣合金降解速率快，但兩者的降解產物均未對大鼠正常的機體內環(huán)境及電解質水平造成明顯影響，生物毒性小，安全性較高。

綜上所述，作者設計的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金具有良好的生物相容性，安全性高，添加殼聚糖涂層后延緩了其降解速率，初步展現(xiàn)出一定的臨床應用價值。但本研究觀察周期短、實驗樣本少，尤其是在此合金降解后產物成分及量的分析，術后不同時間合金對實驗動物心臟、肝臟、腎臟等臟器的影響等方面，仍需更加微觀細致的長期研究。