模擬氮沉降和增溫對(duì)荒漠草原土壤細(xì)菌群落組成和多樣性的影響

黃 靜，楊英花，張國剛，賈美清，韓國棟

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市水資源與水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010019）

氮沉降和氣候變暖已成為全球氣候變化的2個(gè)主要特征[1].到21世紀(jì)末陸地氣候會(huì)繼續(xù)變暖，平均地表溫度將升高1.8～4.0℃[2].20世紀(jì)由于人類活動(dòng)導(dǎo)致的大氣氮沉降已增加了3～5倍[2]，據(jù)預(yù)測(cè)到2050年氮沉降的速率將會(huì)翻一番[3].Jia等[4]基于1980—2010年公開發(fā)表數(shù)據(jù)的分析表明，中國大氣氮沉降的平均值已由每公頃11.11 kg上升到每公頃13.87 kg，增加了近25%.在全球氣候變暖的大環(huán)境下，近50 a我國草原區(qū)氣候明顯變暖[5]，內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)的氮沉降量也已達(dá)到了每年0.4～0.6 g/m2[6]，氮沉降和氣候變暖已成為內(nèi)蒙古草原面臨的主要環(huán)境問題.內(nèi)蒙古荒漠草原屬于典型草原向荒漠過渡的植被類型，是內(nèi)蒙古草原的重要組成部分，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和維持生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用.近年來，由于氣候變化以及過度放牧等人為干擾，荒漠草原出現(xiàn)了嚴(yán)重退化，草地的服務(wù)功能受到了嚴(yán)重威脅.

土壤微生物直接參與土壤的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，在土壤碳循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[7].目前，氣候變化對(duì)荒漠草原影響方面的研究以地上植物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性居多[8-9]，在土壤特性[10]、土壤呼吸[11]等方面也取得了一些研究成果.土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)功能的重要因素.本課題組前期對(duì)內(nèi)蒙古荒漠草原土壤微生物的空間分布特征進(jìn)行了初步研究[12-14].為了實(shí)現(xiàn)氣候變化大背景下對(duì)荒漠草原的合理管理和可持續(xù)利用，本研究通過人工施肥模擬氮沉降和遠(yuǎn)紅外線輻射器加熱模擬氣候變暖，經(jīng)過連續(xù)6 a的模擬實(shí)驗(yàn)后，采用稀釋平板涂布法和16S rRNA分子鑒定技術(shù)探究了氮沉降和氣候變暖對(duì)內(nèi)蒙古荒漠草原土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成和多樣性的影響.

1 材料與方法

1.1 樣地概況和設(shè)計(jì)

樣地位于內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市農(nóng)牧科學(xué)院四子王旗實(shí)驗(yàn)站內(nèi)（41°47′17″N， 111°53′46″E）， 該地區(qū)為中溫帶大陸性季風(fēng)氣候.海拔1 456 m，多年平均降水量為248 mm，其中6—9月份的降水量占全年總降水量的70%以上，年均蒸發(fā)量為2 947 mm，多年平均氣溫3.4℃.植被類型是以短花針茅（Stipa breviflora）為建群種的荒漠草原，伴生種有木地膚（Kochiaprostrata）、無芒隱子草（Cleistogenes songorica）和冷蒿（Artemisia frigida）等.

如文獻(xiàn)[14]所述，于2006年5月在野外自然條件下開始增溫和氮沉降的模擬實(shí)驗(yàn).采用二因素完全隨機(jī)區(qū)組裂區(qū)設(shè)計(jì)，設(shè)置12個(gè)3 m×4 m的實(shí)驗(yàn)區(qū).為了避免干擾，實(shí)驗(yàn)區(qū)間設(shè)置了緩沖帶（3 m×3 m）.隨機(jī)對(duì)其中的6個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行增溫處理.對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的一半進(jìn)行增氮處理，另一半不進(jìn)行增氮處理，在增氮和不增氮處理間設(shè)有30 cm深的物理隔離.共計(jì)24個(gè)小區(qū)，即不增氮不增溫（N0W0）、增氮不增溫（N1W0）、不增氮增溫（N0W1）和增氮增溫（N1W1）4個(gè)處理，每個(gè)處理6次重復(fù).在每個(gè)增溫實(shí)驗(yàn)區(qū)的中央部位距地面2.25 m垂直高度處安裝一臺(tái)功率為2 kW的遠(yuǎn)紅外線輻射器，不間斷地進(jìn)行加熱以模擬增溫處理.為降低誤差，在不增溫小區(qū)距地面2.25 m處也安裝1臺(tái)鐵皮制的與遠(yuǎn)紅外線輻射器大小相同的“假燈”.采用每年6—7月份雨季人工施加NH4NO3的方式（每年每平方米施加10g）模擬增氮.對(duì)不增氮不增溫（N0W0）、增氮不增溫（N1W0）和增氮增溫（N1W1）3個(gè)處理進(jìn)行分析.

1.2 樣品采集和處理

2012年8月，用直徑5 cm的土鉆在每個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)采集0～30 cm的土樣，經(jīng)充分混勻后將其均分為2份，用塑料封口袋密封，低溫4℃下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室.其中一份立即進(jìn)行土壤含水量的測(cè)定，另一份置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3 主要儀器和試劑

1.3.1 儀器

PCR擴(kuò)增儀（TC-960F），瑞士Blue Marlin公司；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+），美國Bio-Rad公司；人工氣候箱（PQX-250H），廊坊市中儀國科儀器儀表有限公司.

1.3.2 試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基、Taq Es DNA聚合酶、土壤DNA提取試劑盒和BBI染液，生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.4 土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)

制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng).取1 g經(jīng)充分混勻的新鮮土壤樣品于裝有100 mL無菌水的錐形瓶中，150 r/min下震蕩20 min.取此濃度的土壤混懸液進(jìn)行梯度稀釋，以平板培養(yǎng)的菌落數(shù)為30～300個(gè)為便于計(jì)數(shù)的濃度，確定土壤混懸液的最佳質(zhì)量濃度為1×10-4g/mL.取200 μL土壤混懸液，用涂布器均勻涂布于平板（Φ=90 mm）上，同一樣品分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d.根據(jù)文獻(xiàn)[15]，按照菌落特征經(jīng)初步分類和編號(hào)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù).最后挑取不同菌種的代表性菌落進(jìn)行分離與純化.

1.5 土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的分子鑒定

1.5.1 土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA PCR擴(kuò)增

用土壤DNA提取試劑盒提取可培養(yǎng)細(xì)菌菌落的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′） .PCR 擴(kuò)增體系為 50 μL：10×Es Buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）各 4 μL，上、 下游引物各2 μL，Tap Es DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL， DNA 模板（10 ng/μL）1 μL， 用超純水補(bǔ)足至50 μL.PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min后進(jìn)行30次擴(kuò)增循環(huán)，即94℃變性1 min、55℃退火45 s、72℃延伸45 s，72℃延伸10 min.擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳時(shí)間為25 min.

1.5.2 土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的分子鑒定

將電泳能夠檢測(cè)到條帶的可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行比對(duì)，下載高質(zhì)量的序列進(jìn)行后續(xù)分析.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel和Sigmaplot12.5進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和圖表處理.采用SPSS13.0進(jìn)行單因素方差（One-WayANOVA）分析，利用Tukey HSD比較不同處理中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量和多樣性指數(shù)的差異.利用Bio-dap軟件計(jì)算可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性指數(shù)，包括物種豐富度指數(shù)（S）、香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)（H′）、均勻度指數(shù)（E）和相對(duì)豐度（Relative abundance），計(jì)算公式如下：

式中：Ni為每一個(gè)樣點(diǎn)分離出的全部種屬的數(shù)目.

式中：Pi為第i種個(gè)體數(shù)占樣品總個(gè)體數(shù)N的比例，Pi=ni/N，ni是第i種的菌株數(shù)，N是所有個(gè)體數(shù)的和.

式中：Hmax=ln S；H′為實(shí)際觀察的香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)；Hmax為最大的香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)；S為物種豐富度指數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的種屬特征

從內(nèi)蒙古短花針茅荒漠草原土壤中共分離獲得14種細(xì)菌，根據(jù)可培養(yǎng)細(xì)菌菌落16S rRNA序列分析結(jié)果和細(xì)菌鑒定手冊(cè)[15]，這些細(xì)菌分別隸屬于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），如表1所示.

表1 可培養(yǎng)細(xì)菌菌株16S rRNA基因序列與最相似菌株的相似性Tab.1 Similarity of 16S rRNA gene sequence between the isolated cultivable bacteria and their closest strains

分離到的14種細(xì)菌中，有8種隸屬于厚壁菌門，代表性菌株編號(hào)分別為XJ2（芽孢桿菌，Bacillus sp.CRRI-93_SW Azo）、XJ11（類芽孢桿菌，Paenibacillus castaneae）、XJ19（Uncultured Trichococcussp.QRSYY9）、XJ21（葡萄球菌，Staphylococcus sp.AJAR-J1）、XJ35（梭菌，Clostridium sp.）、XJ40（芽孢桿菌，Bacillus subtilis strainCYBS-19）、XJ43（芽孢桿菌，Bacillus sp.KT15）和XJ44（芽孢桿菌，Bacillus sp.W30）.其中，XJ2、XJ40、XJ43和XJ44隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），XJ11隸屬于類芽胞桿菌屬（Paenibacillus），XJ19隸屬于Trichococcus屬，XJ21隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），XJ35隸屬于梭菌屬（Clostridium）.XJ15（假單胞菌，Pseudomonas sp.R-45822）隸屬于γ-變形菌綱假單胞菌屬（Pseudomonas）.XJ5（金黃桿 菌 ，Chryseobacterium sp.）和 XJ9（金黃桿菌，Chryseobacterium sp.S63.04.P.COS.HB.H.Ulcer.D.M）隸屬于擬桿菌門金黃桿菌屬（Chryseobacterium），XJ13（Pontibacter sp.Al-Dhabi-10）隸屬于擬桿菌門Pontibacter屬.XJ10（棒形桿菌，Uncultured Clavibacter sp.）隸屬于放線菌門Clavibacter屬， XJ39（雙歧桿菌，Uncultured Bifidobacterium sp.）隸屬于放線菌門雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）.除XJ39外，其他分離獲得的代表性菌株與GenBank中序列最相似菌種的相似性均≥97%，XJ39可能是潛在的新種.

2.2 增氮和增溫處理對(duì)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量、群落組成和多樣性的影響

不同處理下，短花針茅荒漠草原土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量、群落組成和多樣性如表2所示.

表2 不同處理中土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量、群落組成及相對(duì)豐度Tab.2 Quantity，community composition and the relative abundance of the cultivable bacteria in different treatments

由表2可以看出，增氮不增溫和不增氮不增溫處理小區(qū)中的可培養(yǎng)細(xì)菌物種數(shù)均為12種.XJ2（厚壁菌門芽孢桿菌屬）、XJ35（梭菌屬）和 XJ15（γ-變形菌綱假單胞菌屬）是不增氮不增溫處理中的優(yōu)勢(shì)種，其相對(duì)豐度分別為14.03%、45.22%和15.50%.經(jīng)增氮不增溫處理后，XJ2、XJ35和XJ15的相對(duì)豐度沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05），分別為15.67%、39.12%和8.03%.與不增氮不增溫處理相比，增氮不增溫處理顯著增加了XJ13（擬桿菌門Pontibacter屬）的相對(duì)豐度（P＜0.05），由5.72%上升到8.77%.另外，經(jīng)增氮不增溫處理后，XJ11（厚壁菌門類芽孢桿菌屬）和XJ44（芽孢桿菌屬）出現(xiàn)，XJ39（放線菌門雙歧桿菌屬）和XJ43（厚壁菌門芽孢桿菌屬）消失.

與不增溫不增氮處理相比，增溫增氮處理使XJ2和XJ35的相對(duì)豐度降低，XJ2的相對(duì)豐度由14.03%降至7.52%，XJ35的相對(duì)豐度由45.22%降至26.78%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.XJ15和XJ40（厚壁菌門芽孢桿菌屬）的相對(duì)豐度均顯著升高（P＜0.05），XJ15的相對(duì)豐度由不增氮不增溫處理的15.50%升高到增氮增溫處理的41.02%，并且成為增氮增溫處理中的優(yōu)勢(shì)種，XJ40的相對(duì)豐度由不增氮不增溫處理中的0.51%升高到增氮增溫處理的8.17%.另外，XJ21（厚壁菌門葡萄球菌屬）、XJ39、XJ43在增氮增溫處理中消失.總的來看，增氮不增溫處理和增氮增溫處理使土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的總數(shù)增加，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.

不同處理下短花針茅荒漠草原土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性如圖1所示.由圖1可以看出，增氮不增溫降低了可培養(yǎng)細(xì)菌的物種豐富度指數(shù)（S），但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.增氮不增溫和增氮增溫處理對(duì)可培養(yǎng)細(xì)菌的香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)（H′）、均勻度指數(shù)（E）均沒有產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）.

圖1 不同處理0～30 cm土層中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性Fig.1 Diversity of the cultivable bacteria in different treatments at 0-30 cm soil depth

3 討論與結(jié)論

3.1 增氮不增溫對(duì)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成和多樣性的影響

不同研究中增氮對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量的影響存在差異.Sarathchandra等[16]對(duì)多年生牧草草地的研究結(jié)果顯示，增氮對(duì)細(xì)菌總數(shù)沒有影響.施瑤等[17]在內(nèi)蒙古典型草原連續(xù)6 a的氮磷添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著氮添加量的增加，土壤細(xì)菌PLFA生物標(biāo)記數(shù)量表現(xiàn)出上升趨勢(shì).譚成玉[18]對(duì)東北羊草草原進(jìn)行連續(xù)2 a的增溫和增氮實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，增氮使細(xì)菌數(shù)量增加了16%.本研究對(duì)內(nèi)蒙古短花針茅荒漠草原的土壤細(xì)菌進(jìn)行增氮增溫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增氮不增溫處理增加了可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量，但是與不增氮不增溫處理相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.Frey等[19]研究表明，長期增氮會(huì)造成土壤酸化，破壞其結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響微生物的生存.本實(shí)驗(yàn)區(qū)的增氮不增溫處理對(duì)0～30 cm土壤的pH基本沒有影響，所以推測(cè)增氮造成的土壤酸化和對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞可以忽略.Craine等[20]的微生物氮礦化假說認(rèn)為，土壤微生物利用易分解的碳來降解有機(jī)物以獲得氮，這一過程受氮的可利用性的限制.李元恒[21]的研究表明，增氮效應(yīng)增加了實(shí)驗(yàn)區(qū)的地下凈初級(jí)生產(chǎn)力.本研究中，增氮并未使土壤細(xì)菌數(shù)量顯著增加，究竟是因?yàn)橹参锱c土壤微生物對(duì)氮的可利用性存在競爭關(guān)系，還是因?yàn)榈牡V化，或者是二者的共同作用，這有待于進(jìn)一步研究.

增氮對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響在不同研究中也存在分歧.劉昭霞[22]對(duì)添加氮后的稀樹草叢土壤細(xì)菌的研究表明，增氮能夠增加土壤細(xì)菌的多樣性和豐富度.隋心等[23]對(duì)三江平原濕地土壤細(xì)菌的研究表明，氮添加能夠增加土壤細(xì)菌的群落多樣性.楊山等[24]對(duì)典型溫帶草原的氮添加實(shí)驗(yàn)表明，增氮對(duì)土壤細(xì)菌的豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)和香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)均沒有顯著影響.這可能與增氮的量、增氮持續(xù)的時(shí)間長度、研究方法及生態(tài)系統(tǒng)等有關(guān).Zeng等[25]研究認(rèn)為，增氮既能夠直接影響微生物的多樣性，還可以通過土壤pH值和植物群落的改變間接影響微生物的群落結(jié)構(gòu).本研究中，增氮不增溫處理改變了可培養(yǎng)細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，但對(duì)于可培養(yǎng)細(xì)菌的總數(shù)、物種豐富度、均勻度和香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)均沒有顯著影響.

3.2 增氮增溫對(duì)土壤細(xì)菌的影響

增溫增氮對(duì)土壤微生物的影響也沒有統(tǒng)一結(jié)論.Rinnan等[26]對(duì)苔原土壤微生物的研究表明，增溫能抑制細(xì)菌生長.高金濤[27]對(duì)中亞熱帶杉林土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，增溫增氮同樣會(huì)抑制細(xì)菌生長.譚成玉[18]對(duì)松嫩草原土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，增溫增氮能夠使細(xì)菌數(shù)量增加11%.Shen等[28]連續(xù)5 a的增溫增氮實(shí)驗(yàn)表明，增溫增氮的交互作用對(duì)土壤微生物幾乎沒有影響.本研究中的增溫增氮處理對(duì)短花針茅荒漠草原土壤細(xì)菌的數(shù)量和多樣性也沒有顯著影響，但改變了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，厚壁菌門的XJ2和XJ35的相對(duì)豐度顯著降低，變形菌門的XJ15和厚壁菌門的XJ40的相對(duì)豐度顯著增加，尤其是XJ15成為土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)種，這可能與生態(tài)系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)地的特異性、增溫持續(xù)時(shí)間、增溫幅度等有關(guān).