60Coγ射線全身照射后大鼠血漿中*GDF-15、Flt-3L和SAA表達(dá)的劑量相關(guān)性研究

孫佳麗 李 爽 田 梅 劉青杰*

輻射損傷的早期生物標(biāo)志物對(duì)核事故或者核恐怖襲擊中受照人群進(jìn)行分類和治療至關(guān)重要。研究表明，有些蛋白質(zhì)可以作為候選的輻射生物標(biāo)志物，輔助估算輻射暴露劑量[1-2]。Fms樣酪氨酸激酶3配體(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)lt-3L)和血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid a protein，SAA)在輻照后的小鼠和非人靈長(zhǎng)類的血漿中表達(dá)增高，有研究將其作為輻射敏感候選生物標(biāo)志物[3-4]。然而，F(xiàn)lt-3L和SAA在輻照后大鼠血漿中的表達(dá)情況尚不清楚。Flt-3L蛋白是一種內(nèi)源性小分子，可以通過(guò)激活造血祖細(xì)胞增加免疫細(xì)胞(B細(xì)胞和T細(xì)胞)的數(shù)量；還可以動(dòng)員體內(nèi)造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞，這可能有助于機(jī)體殺死癌細(xì)胞[5]。SAA是在炎癥的急性期分泌，具有多種功能，包括將免疫細(xì)胞募集到炎癥部位，以及誘導(dǎo)酶降解細(xì)胞外基質(zhì)等[6]。

生長(zhǎng)分化因子-15(growth differentiation factor-15，GDF-15)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的一種蛋白質(zhì)，在心血管疾病中觀察到GDF-15蛋白有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[7]。在前期研究中，利用基因芯片技術(shù)篩選輻射差異表達(dá)基因，其中GDF-15基因是所有基因中受電離輻射誘導(dǎo)后表達(dá)變化最為顯著的基因[8]。通過(guò)γ射線和锎252(252Cf)中子源照射人永生化淋巴細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)表達(dá)水平也呈現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系[9]。但是，細(xì)胞株輻照后的變化不能反應(yīng)全身照射后的電離輻射引起的改變，有必要研究全身照射后血漿GDF-15蛋白的表達(dá)情況。因此，本研究通過(guò)分析大鼠全身照射后Flt-3L、SAA和GDF-15蛋白在血漿中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探究作為大鼠全身照射的輻射敏感蛋白可能性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)(Sprague Dawley， SD)大鼠72只，雄性，8周，體重(230±10)g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0010)，在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部飼養(yǎng)，屏障環(huán)境使用許可證：SYXK(京)2016-0041)。飼養(yǎng)條件的溫度為(22±2)℃，相對(duì)濕度為40%～60%，噪聲dB聲濕度。實(shí)驗(yàn)前將大鼠按標(biāo)準(zhǔn)采食量飼喂并自由飲水1周，觀察大鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)，將生長(zhǎng)健康的大鼠納入研究。將72只健康SD大鼠按照照射劑量分為0 Gy組、1 Gy組、3 Gy組和5 Gy組，每組18只，每6只飼養(yǎng)在同一籠里。本研究的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射安全所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 材料與儀器

(1)材料。Flt-3L酶鏈免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒和SAA ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于武漢華美生物工程有限公司；GDF-15 ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于美國(guó)R&D公司。

(2)儀器。MR23i低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific)；Thermo Labsystems MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific)。

1.3 照射方法

采用60Co γ射線照射大鼠，60Co γ射線輻照源由北京市輻照中心提供，源強(qiáng)130 TBq，源靶距84 cm，照射視野面積30 cm×30 cm，單次全身照射，劑量率為1 Gy/min，每組劑量分別為0 Gy、1 Gy、3 Gy和5 Gy。

1.4 樣品采集及處理

經(jīng)60Co γ射線照射1 d、3 d和5 d后，通過(guò)大鼠眼眶內(nèi)眥靜脈采血，采集的血液存放在EDTA抗凝負(fù)壓管中，30 min內(nèi)離心，4 ℃，3000 r/min，離心10 min，取上清，分離的血漿分裝后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 血漿蛋白ELISA檢測(cè)方法

將各種試劑移至室溫平衡30 min備用；分別向標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔中加樣100 μl，輕輕晃動(dòng)后于37 ℃溫育2 h；棄去液體甩干，不洗滌；每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μl，于37 ℃溫育1 h；棄去液體甩干，洗板3次，每次每孔200μl洗滌液，每次2 min，甩干；每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μl，于37 ℃溫育1 h；棄去液體甩干，洗板5次，每次每孔200μl洗滌液，每次2 min，甩干；每孔加入底物溶液90μl，于37 ℃避光顯色15～30 min后，每孔加入終止溶液50μl，終止反應(yīng)。終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

ELISA數(shù)據(jù)采用標(biāo)準(zhǔn)品及樣品值減去S0孔數(shù)值(S0孔是標(biāo)準(zhǔn)孔中只加稀釋液，未加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的校正孔)，復(fù)孔取其平均值后，繪制曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，利用專業(yè)制作曲線的軟件“Curve Expert”進(jìn)行繪圖并計(jì)算出樣本濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多個(gè)樣本均數(shù)間比較經(jīng)過(guò)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析(oneway， ANOVA)；若方差分析組間效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，表示至少有兩組的總體均數(shù)不同，采用LSD-t檢驗(yàn)(least significance difference test)進(jìn)一步分析組與組之間的差別。采用線性回歸方法建立劑量-效應(yīng)方程，ANOVA分析劑量-反應(yīng)曲線方程的意義，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀態(tài)

照射后大鼠進(jìn)食與飲水情況良好，無(wú)死亡，未觀察到明顯的脫毛嘔吐現(xiàn)象。照射后1 d和3 d，1 Gy組、3 Gy組和5 Gy組的大鼠體重與0 Gy組相比，體重明顯降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.20，t=2.34，t=8.05，t=5.09，t=5.34，t=9.59；P＜0.05)，見(jiàn)表1；照射后5 d，3 Gy組和5 Gy組與0 Gy組比較，大鼠體重降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.74，t=10.06；P＜0.05)。5 Gy劑量組大鼠的體重，隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng)，體重并未升高，1 Gy組和3 Gy組大鼠的體重，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)體重有不同程度的增長(zhǎng)。

表1 SD大鼠不同時(shí)間全身照射前后體重的變化(±s)

表1 SD大鼠不同時(shí)間全身照射前后體重的變化(±s)

不同時(shí)間照射后體重(g)1 d t值 P值 3 d t值 P值 5 d t值 P值0 Gy組 6 230.2±8.84 281.2±5.08 - - 301.0±2.61 - - 305.3±11.54 - - 1 Gy組 6 230.2±10.26 242.6±9.33 6.20 ＜0.05 258.8±12.52 5.09 ＜0.05 296.0±4.00 0.17 ＞0.05 3 Gy組 6 229.7±9.16 240.4±8.69 2.34 ＜0.05 259.2±10.40 5.34 ＜0.05 276.6±14.28 2.74 ＜0.05 5 Gy組 6 231.3±8.86 228.0±11.34 8.05 ＜0.05 226.0±14.79 9.59 ＜0.05 221.0±7.09 10.06 ＜0.05組別 樣本數(shù)(只)照射前1周體重(g)

2.2 GDF-15蛋白表達(dá)變化

在每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，血漿中GDF-15蛋白的表達(dá)量隨著照射劑量的增加而明顯升高。各劑量組與0 Gy組比較，其GDF-15蛋白均在照后1 d達(dá)到最高值，1 Gy組血漿GDF-15蛋白濃度為(313.71±19.08)pg/ml，3 Gy組為(672.75±133.33)pg/ml，5 Gy組為(1402.54±526.08)pg/ml。照后1 d，1 Gy組血漿中GDF-15蛋白表達(dá)升高4倍，3 Gy組升高9倍，5 Gy組升高18倍；照后3 d和5 d，3 Gy組和5 Gy組的GDF-15蛋白表達(dá)量與0 Gy組相比，表達(dá)增高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.09，t=6.32，t=8.91，t=10.71，t=2.73，t=6.64，P＜0.05)。各劑量組中，同一劑量點(diǎn)GDF-15蛋白的表達(dá)量均在照射后1d達(dá)到最高值，隨著照射后時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量降低，如圖1所示。

圖1 60Co γ射線全身照射后SD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中GDF-15蛋白的表達(dá)變化示圖

照射后1 d、3 d和5 d，大鼠血漿中的GDF-15蛋白表達(dá)量與照射劑量之間呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，擬合直線方程的R2≥0.887，見(jiàn)表2。

表2 60Co γ射線全身照射后SD大鼠血漿GDF-15蛋白表達(dá)水平的劑量-效應(yīng)關(guān)系

2.3 Flt-3L蛋白表達(dá)變化

大鼠血漿Flt-3L的表達(dá)量在照射后1 d、3 d和5 d，有隨劑量升高而升高的趨勢(shì)，照射后5 d的劑量-效應(yīng)趨勢(shì)最好。在照射后1 d、3 d和5 d，與0 Gy組比較，5 Gy組血漿中Flt-3L的表達(dá)量均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.22，t=8.48，t=5.51；P＜0.05)；3 Gy組只在照后1 d和5 d表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.79，t=3.69；P＜0.05)。在照射后3 d，1 Gy組和5 Gy組照射的大鼠血漿Flt-3L的表達(dá)量達(dá)到最高值，1 Gy組達(dá)到(161.34±28.47)pg/ml，5 Gy組為(239.04±51.49)pg/ml。3 Gy組照射后Flt-3L的表達(dá)量在照后1 d達(dá)到最高值，濃度為(198.96±26.22)pg/ml。各劑量組在照射后隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，血漿中Flt-3L的表達(dá)呈波動(dòng)變化，如圖2所示。

圖2 60Co γ射線全身照射后SD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中Flt-3L蛋白的表達(dá)變化示圖

照射后3 d和5 d，大鼠血漿中的Flt-3L蛋白表達(dá)量與照射劑量之間呈現(xiàn)出了良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，擬合直線方程的R2≥0.861，見(jiàn)表3。

表3 60Co γ射線全身照射后SD大鼠血漿Flt-3L表達(dá)水平的劑量-效應(yīng)關(guān)系

2.4 SAA蛋白表達(dá)變化

在照射后1 d、3 d和5 d，大鼠血漿中SAA的表達(dá)量隨著照射劑量升高變化趨勢(shì)不同，只有照射后1 d，有隨著照射劑量升高SAA表達(dá)量增加的趨勢(shì)。照射后1 d和3 d，5 Gy組SAA的表達(dá)量與0 Gy組比較表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.53，t=2.28；P＜0.05)；照射后5 d各劑量組與0 Gy組比較，SAA的表達(dá)量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.71，P＞0.05)，如圖3所示。

圖3 60Co γ射線全身照射后SD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中SAA蛋白的表達(dá)變化示圖

3 討論

有研究表明，小鼠在照射后會(huì)出現(xiàn)體重等身體機(jī)能指標(biāo)的變化。本研究發(fā)現(xiàn)照射后SD大鼠出現(xiàn)了體重下降或者體重增長(zhǎng)變緩的情況。Ossetrova等[3]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在照射1～3 Gy和6～8 Gy時(shí)，均是在照射后3 d體重下降最明顯。本研究中大鼠在照后1 d與0 Gy組相比，其他3組體重有明顯的下降，可能是暴露于照射因素以及運(yùn)輸中的不良環(huán)境等綜合因素導(dǎo)致；照后3 d、5 d，1 Gy組和3 Gy組大鼠體重都有增長(zhǎng)，5 Gy組大鼠體重未見(jiàn)增長(zhǎng)，表明照射對(duì)大鼠的生長(zhǎng)造成了一定影響。

GDF-15基因是TGF-1家族的一個(gè)成員，可以被IL-1、IL-2和TNF-9等細(xì)胞因子激活，最早在巨噬細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[4]。是DNA損傷信號(hào)傳導(dǎo)的重要下游介導(dǎo)物[10]。多種化學(xué)應(yīng)激和環(huán)境因子誘導(dǎo)GDF-15表達(dá)升高，提示GDF-15在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[11]。Sándor等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GDF-15蛋白在輻照后人成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高，可能成為輻射誘導(dǎo)細(xì)胞的早期生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)室研究也證實(shí)GDF-15蛋白在照射后人永生化淋巴細(xì)胞株中表達(dá)增高，并具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系[9]。本研究中GDF-15蛋白在大鼠照后1 d血漿中的量效關(guān)系最好，這與其在照射后的人永生化淋巴細(xì)胞株中的表達(dá)情況相同，不同點(diǎn)在于兩個(gè)研究中GDF-15蛋白表達(dá)量上的差別，如照后1 d的人永生化淋巴細(xì)胞株中GDF-15蛋白在5 Gy組的表達(dá)量是0 Gy組的2倍，在相同條件下，全身照射5 Gy組的大鼠血漿中GDF-15蛋白表達(dá)量是0 Gy組的18倍。

Flt-3L是調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)最重要的細(xì)胞因子之一，其作用是刺激各種造血祖細(xì)胞的增殖和分化。由于在小鼠和非人靈長(zhǎng)類的研究中表現(xiàn)出對(duì)骨髓照射的高度特異性，F(xiàn)lt-3L被作為輻射誘導(dǎo)的骨髓再生障礙嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠血漿中Flt-3L的表達(dá)情況和一些研究中小鼠中的表達(dá)趨勢(shì)相似；Kim等[15]采用X射線照射小鼠、Sproull等[16]和Ostrava等[17]采用γ射線照射小鼠，全身照射劑量在1～6 Gy，照射后1～5 d，小鼠血漿中Flt-3L的表達(dá)都隨著受照射劑量的增加表達(dá)量升高，而且研究發(fā)現(xiàn)小鼠血漿中Flt-3L在照射后2 d和3 d的量效趨勢(shì)很好；在非人靈長(zhǎng)類的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lt-3L在照射后2 d和7 d的量效趨勢(shì)最好[18]。本研究中Flt-3L的表達(dá)在照射后各時(shí)間點(diǎn)有隨照射劑量增加而升高的趨勢(shì)，用Flt-3L擬合劑量-效應(yīng)曲線，照射后1 d，劑量-效應(yīng)關(guān)系不太理想，照射后3 d和5 d擬合的曲線比較好。

SAA通過(guò)刺激細(xì)胞因子在肝臟中合成，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用；SAA可在輻射刺激后數(shù)日檢測(cè)到，其是否發(fā)生顯著性變化取決于頭部是否在輻射場(chǎng)中；SAA動(dòng)態(tài)變化水平可以作為反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程和急性放射病嚴(yán)重程度的候選指標(biāo)，并可作為非均勻輻射暴露譜中輻射暴露的生物標(biāo)志物[19-21]。SAA是急性反應(yīng)蛋白，輻射等刺激因素出現(xiàn)后，SAA表達(dá)會(huì)升高。有研究發(fā)現(xiàn)，照射后小鼠血漿中SAA在4 h后表達(dá)量開(kāi)始增多，照射后1 d表達(dá)量達(dá)到頂峰，其中5 Gy組的表達(dá)量是基線水平的10倍左右[3，20，22]。然而，本研究中大鼠全身照射5 Gy組的表達(dá)量?jī)H為基線水平的1.82倍，推測(cè)可能是大鼠血漿中SAA蛋白對(duì)輻射敏感度較低。Blakely等[23]在研究X射線照射后的CD2F1小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，血漿中SAA的表達(dá)量并不表現(xiàn)依賴照射劑量增加而升高。由此可以看出SAA作為輻射敏感蛋白在不同的實(shí)驗(yàn)中表達(dá)可能并不穩(wěn)定。由于本研究的數(shù)據(jù)有限，關(guān)于SAA在大鼠血漿中的表達(dá)情況還有待進(jìn)一步研究。

Flt-3L蛋白在大鼠全身照射后5 d呈現(xiàn)出最好的劑量-效應(yīng)關(guān)系， GDF-15蛋白在大鼠全身照射后1 d呈現(xiàn)出最好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。但是，由于本研究樣本數(shù)量有限，血漿中Flt-3L和GDF-15蛋白能否作為大鼠全身照射后候選的輻射敏感生物標(biāo)志物還有待深入探索。