HPLC-DAD法檢測桑葉中的1-脫氧野尻霉素

高林森，溫吉更，李亞麗，郭 燁

（河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟(jì)研究所，河北石家莊 050051）

我國桑葉資源十分豐富，分布面積廣，但在桑葉的利用方面較差（姜貝貝等，2017）。桑屬植物中含有豐富的生物堿。目前已從桑屬植物中分離出十幾種多羥基生物堿，其中，1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）在桑葉中含量較多。1-DNJ是存在于桑屬資源中的一種特殊多羥基生物堿，結(jié)構(gòu)和天然糖相似，是桑葉降血糖的主要活性成分。1-DNJ能夠很好的競爭性抑制α-糖苷酶的活性，因此可以用于肥胖病、糖尿病、抗病毒感染等 （姚佳等2018；Shuang 等，2017；Wen 等，2016；Islam 等 2008），其在體內(nèi)停留時(shí)間較短，無需肝臟代謝，無毒性積累，無細(xì)胞及遺傳毒性，無代謝副產(chǎn)物，也不會(huì)損傷肝腎（王玲等，2017）。

本實(shí)驗(yàn)主要研究桑葉中1-DNJ的定性定量檢測及對(duì)檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，然后對(duì)不同種植條件下桑葉1-DNJ含量的差異性進(jìn)行對(duì)比，預(yù)期找到合適的方法來測定樣品中的1-DNJ，為 1-DNJ的開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 本實(shí)驗(yàn)所用材料和試劑如表1和表2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)藥品

1.2 儀器與設(shè)備 本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)儀器如表3所示。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱取2 mg DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水配制成 2、1、0.5、0.25、0.125、0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理 準(zhǔn)確稱取桑葉粉 0.5 g，加入0.05 mol/L HCl 20 mL，靜置 10 min，超聲處理30 min，10000 r/min 離心 30 min，收集上清液，沉淀物重復(fù)抽提1次，合并2次上清液，用0.05 mol/L HCl定容至 50 mL，得桑葉粉樣品提取液。

1.3.3 1-DNJ的衍生化處理 分別取待測樣品提取液、1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液各 100μL，加入0.4 mol/L K3BO3緩沖液（pH 8.5）100 μL、5 mmol/L FMOC-Cl溶液（溶解于 50%乙腈）100 μL，混勻，靜置 30 min，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后加入 1 mol/L甘氨酸溶液100μL，終止反應(yīng)，最后加入0.1%乙酸溶液 100 μL，混勻靜置 2 h（魏兆軍等，2009）。用0.22μm微孔過濾器過濾，收集濾液待測。

表2 實(shí)驗(yàn)原材料

表3 實(shí)驗(yàn)儀器

1.3.4 色譜條件 島津 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相為 V（乙腈）：V（0.1%乙酸）=40:60混合液，流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 20μL，柱溫30℃，檢測波長 265 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇 實(shí)驗(yàn)利用二極管陣列檢測 器（DAD）的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)選取 254、265、270、275 nm四個(gè)波長進(jìn)行高效液相色譜分析，不同波長下1-DNJ的高效液相色譜圖見圖1。由圖1可知，在吸收波長為265 nm時(shí)，1-DNJ的吸收值最高，其次為254 nm，雖然相差不大，但是在265 nm波段時(shí)，測定樣品中的干擾雜質(zhì)溶出較少，便于檢測，所以最終1-DNJ的檢測波長應(yīng)為265 nm。

圖1 不同波長下1-DNJ標(biāo)品液相色譜圖

2.2 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)比較了0.1%已酸水溶液與乙腈的體積比分別為60:40、55:45和65:35時(shí)，1-DNJ樣品的色譜分離情況。不同流動(dòng)相比例下1-DNJ樣品的高效液相色譜圖見圖2。當(dāng)體積比為55:45和65:35時(shí)，樣品中雜質(zhì)出峰時(shí)間與被分析物出峰時(shí)間相近，不能完全分離，且目標(biāo)物質(zhì)吸收值較低。當(dāng)體積比為60:40時(shí)分離效果良好。因此，選擇體積比為60:40的0.1%已酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相。

2.3 線性關(guān)系與檢測限 根據(jù)分析物的靈敏度， 配制含 1-DNJ 質(zhì)量濃度為 2、1、0.5、0.25、0.125、0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)行測定，用峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物的濃度做圖，其線性方程、線性相關(guān)系數(shù)及線性范圍如表4所示，線性關(guān)系圖見圖3。分析物在濃度0.05～2 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 樣品測定 桑葉樣品按照 1.3中的方法進(jìn)行處理、衍生和測定。通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖、空白色譜圖和桑葉提取液色譜圖。結(jié)果如圖4所示，1-DNJ分離效果好且保留時(shí)間合適。

2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)多個(gè)桑葉樣品分別在 0.05 mg/mL和 0.125 mg/mL 2個(gè)添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。 其平均回收率（AR）為81.3% ～92.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為 4.7% ～6.5%（n=5）。 表明該方法回收率和精密度高，分析方法可行，可用于桑葉中1-DNJ的定性與定量分析。

圖2 不同流動(dòng)相比例下1-DNJ樣品色譜圖

表4 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖3 線性回歸曲線圖

2.6 不同種植條件下1-DNJ含量差異性對(duì)比將多產(chǎn)地春季、秋季不同品種的桑葉分別經(jīng)凍干后，測得1-DNJ含量見表6。分析結(jié)果表明，桑葉季節(jié)性1-DNJ含量差異較大，秋季桑1-DNJ高于春季桑1-DNJ，承德產(chǎn)區(qū)秋季桲欏桑的1-DNJ含量最高，為0.105 mg/mL。檢測結(jié)果為河北省桑葉的產(chǎn)品研發(fā)及1-DNJ的有效利用提供了理論依據(jù)。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)樣品、空白和桑葉提取液色譜圖

表5 樣品加標(biāo)回收率與精密度（n=5）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)色譜峰分離效果好，峰面積與1-DNJ濃度呈高度正相關(guān)關(guān)系，樣品平均加標(biāo)回收率為81.3%～92.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）為 4.7% ～ 6.5%（n=5），精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率的測定結(jié)果均顯示本方法是穩(wěn)定可靠的，可用于桑葉中1-DNJ的檢測。而且對(duì)多種桑葉樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示，秋季桑中1-DNJ的含量高于春季桑，承德產(chǎn)區(qū)秋季桲欏桑的1-DNJ含量最高。

表6 桑葉中1-DNJ含量（n=5）