單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮抑制多發(fā)性骨髓瘤U266細胞增殖作用機制的研究

李 爽鄒建華葉曉鷗張光霽陳 喆

多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一種常見的血液系統(tǒng)漿細胞惡性腫瘤，以漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或者輕鏈蛋白過度增生為特征。MM常以骨痛為主要臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)“骨痹”、“虛勞”、“骨蝕”等范疇。近年來由于MM化療耐藥，患者多數(shù)因耐藥復發(fā)而死亡[1-2]。三氧化二砷（Arsenictrioxide，As2O3）為中藥砒霜的有效成分，具有蝕瘡、去腐、殺蟲、劫痰定喘、劫瘧功效。我國學者首先發(fā)現(xiàn)As2O3治療急性早幼粒細胞性白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）效果顯著，并闡明其主要作用機制是通過促進PML-RAR融合蛋白的降解[3-4]。研究表明，無機砷（As2O3）在體內通過肝臟甲基轉移酶作用下生成單甲基亞砷酸（monomethylarsenous acid，MMAⅢ）、二甲基亞砷酸（dimethylarsenous acid，DMAⅢ）等活性代謝產物從而發(fā)揮相應的生物學效應[5-6]。丹參具有活血化瘀、涼血消癰作用，主治癥瘕積聚、瘡瘍腫痛，為臨床抗腫瘤的常用中藥。隱丹參酮（Cryptotanshinone，CPT）是丹參的有效活性成分，具有較強的抗腫瘤作用。體外研究表明，CPT能明顯誘導肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞凋亡[7]。本研究觀察隱丹參酮聯(lián)合MMA III協(xié)同抗多發(fā)性骨髓瘤U266細胞的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料 多發(fā)性骨髓瘤U266細胞和單甲基砷酸（MMAV）由浙江大學藥學院那仁滿都拉教授饋贈。隱丹參酮（CPT）分子式C19H20O3，相對分子質量296.35，購置于Selleck（中國上海藍木化工有限公司）（批次：S228502）。

1.2 細胞培養(yǎng) 多發(fā)性骨髓瘤U266細胞用含10%gibco胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力 常規(guī)培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤U266細胞。按隱丹參酮單藥組、MMAIII單藥組、聯(lián)合組分別加藥處理。隱丹參酮組加入不同濃度的隱丹參酮（0、5、10、15、30、50μM）、MMAIII組加入不同濃度的單甲基亞砷酸（0、0.5、1、2、5、10μM），聯(lián)合組加入濃度為15μM的隱丹參酮和1μM的單甲基亞砷酸。加入CCK-8并在培養(yǎng)箱中孵育后，檢測吸光度值(OD值)，并計算細胞存活率。

1.4 PI/Annexin-V流式細胞術檢測細胞凋亡 隱丹參酮單藥組（15μM）、MMAIII單藥組（1μM）和聯(lián)合組分別處理細胞后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24h。收集細胞，AnnexinⅤ-FITC和PI染料處理并孵育后流式細胞儀FITC-PI模式下檢測細胞凋亡率。

1.5 Western Blot檢測PARP凋亡蛋白 研究共分為隱丹參酮單藥組（15μM）、MMAIII單藥組（1μM）、聯(lián)合組。十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠后進行蛋白印跡（Western Blot）檢測。特異性一次抗體為抗 Parp、Cleaved-parp、Cleaved-Caspase3（分別 1:1000稀釋）；特異性二次抗體為HRP標記的抗兔或抗小鼠二次抗體。QuantityOne軟件進行量化分析蛋白表達水平，β-actin蛋白水平作為內參。

1.6 酸性鞘磷脂酶活性測定 凍融法裂解細胞，應用BCA法測定蛋白濃度，用1mMPMSF稀釋樣品。每孔加入20μL被PMSF稀釋的含20μg蛋白的樣品液。向96孔板中加入樣品液每孔20μL含20μg蛋白，每組兩復孔。每孔加入30μL底物緩沖液K-3203水平搖床混合5min后每孔加入50μL稀釋好的酸性鞘磷脂酶底物（酸性鞘磷脂酶底物k-3202：底物緩沖液k-3203=1：40）混合均勻后水平恒溫搖床37℃孵育3h。在室溫下每孔加入50μL終止緩沖液k-3204避光室溫水平搖床孵育10min，多功能酶標儀激發(fā)波長360nm發(fā)射波長460nm下檢測讀板，軟件Prism 6.0繪制曲線。

1.7 免疫熒光檢測神經(jīng)酰胺生成與聚集情況 隱丹參酮單藥組、MMAIII單藥組、聯(lián)合應用組分別加藥處理，0、1、2、4、8h 后收集細胞。用細胞涂片離心機（1500rpm，2min）將細胞轉移到細胞爬片上晾干。干燥后的細胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次動作輕柔避免細胞從爬片上脫落。封閉液（含5%BSA的PBS溶液）封閉1h。一抗神經(jīng)酰胺（ceramide，1：100稀釋）4℃過夜。再用 PBS洗3次，5min/次。室溫避光孵育二抗1h。再用PBS避12光洗3次，5min/次。在暗室中取出細胞爬片濾紙吸干多余的水分，將載玻片上滴加約10μL的不含DAPI的封片劑（Southern Biotech），將含有細胞側的玻片輕輕覆蓋在封片劑上，避免出現(xiàn)氣泡。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 免疫熒光檢測脂筏聚集情況 常規(guī)培養(yǎng)人多發(fā)性骨髓 U266細胞，接種于 24孔板中（4×104個/孔）待細胞生長至50～60%融合率后按空白對照組，聯(lián)合應用組，F(xiàn)ilipin組（filipin預處理2h后再加入隱丹參酮15μM和單甲基亞砷酸1μM）分別加藥處理3h后收集細胞PBS洗2遍后。用細胞涂片離心機（1500rpm，2min）將細胞轉移到細胞爬片上晾干。干燥后的細胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次動作輕柔避免細胞從爬片上脫落。封閉液（含5%BSA的PBS溶液）封閉1h。脂筏特異性熒光標記物霍亂毒素B（choleratoxinB，CTB）：37℃避光孵育1h，再用PBS避光洗3次，5min/次。在暗室中取出細胞爬片濾紙吸干多余的水分，將載玻片上滴加約10μL的含DAPI的封片劑（Southern Biotech），將含有細胞側的玻片輕輕覆蓋在封片劑上，避免出現(xiàn)氣泡。激光共聚焦微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同應用顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖 隱丹參酮濃度為15μM時細胞存活率為 （80.9±5.4）%（24h）、（60.0±8.4）%（48h），單甲基亞砷酸濃度為1μM時細胞存活率為（82.5±5.8）%（24h）、（67.7+9.7）%（48h），隱丹參酮（15μM）聯(lián)合單甲基亞砷酸（1μM）作用于多發(fā)性骨髓瘤U266細胞24h、48h后細胞存活率為（29.1±7.0）%（24h）、（18.0±2.7）%（48h）。上述實驗結果表明，隱丹參酮、單甲基亞砷酸對多發(fā)性骨髓瘤的增殖抑制作用呈濃度及時間依賴性，且隱丹參酮（15μM）及單甲基亞砷酸（1μM）聯(lián)合作用U266具有顯著的協(xié)同效應，其對細胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于單獨應用（P＜0.01）（見插頁圖 1）。

圖1 隱丹參酮單藥組、單甲基亞砷酸單藥組及聯(lián)合用藥組對人多發(fā)性骨髓瘤U266細胞增殖抑制作用

2.2 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用顯著促進多發(fā)性骨髓瘤U266細胞凋亡發(fā)生 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，5μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數(shù)生長期的多發(fā)性骨髓瘤U266細胞24h，經(jīng)AnnexinV-FITC/PI染色后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果顯示，聯(lián)合用藥組細胞凋亡率為（41.7±4.4）%、單甲基亞砷酸組為（10.6±4.0）%、隱丹參酮組為（10.5±3.0）%。上述結果顯示聯(lián)合用藥組較單甲基亞砷酸單藥組、隱丹參酮單藥組能顯著促進多發(fā)性骨髓瘤U266細胞發(fā)生凋亡（P＜0.01）（見插頁圖 2）。

圖2 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用顯著誘導U266細胞凋亡發(fā)生

2.3 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用能夠活化多發(fā)性骨髓瘤U266細胞凋亡標記蛋白 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數(shù)生長期的多發(fā)性骨髓瘤U266細胞24h后，收集細胞提取細胞總蛋白Western Blot法檢測PARP凋亡蛋白活化情況，結果顯示，聯(lián)合作用組凋亡蛋白PARP剪切活化水平較單甲基亞砷酸單藥組及隱丹參酮單藥組有顯著升高（見插頁圖3）。上述結果說明單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮通過活化凋亡標記蛋白進而誘導多發(fā)性骨髓瘤U266細胞凋亡發(fā)生。

圖3 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用促進U266細胞凋亡相關蛋白剪切活化

2.4 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用促進多發(fā)性骨髓瘤U266細胞神經(jīng)酰胺的生成 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數(shù)生長期的多發(fā)性骨髓瘤U266細胞。收集細胞處理樣本后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞膜上神經(jīng)酰胺生成聚集情況。結果顯示，上述藥物作用2h，單甲基亞砷酸及隱丹參酮單獨作用組神經(jīng)酰胺熒光亮度與對照組無明顯差別，聯(lián)合用藥組熒光亮度則明顯增強（見插頁圖4），上述實驗結果說明藥物聯(lián)合作用較單獨作用顯著促進人多發(fā)性骨髓瘤細胞神經(jīng)酰胺的生成。

圖4 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用促進U266細胞膜上神經(jīng)酰胺生成

2.5 單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮協(xié)同作用顯著增加多發(fā)性骨髓瘤U266細胞的酸性鞘磷脂酶活性 單甲基亞砷酸單藥組（MMAIII，1μM），隱丹參酮單藥組（CPT，15μM），聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白對照組分別作用于對數(shù)生長期的多發(fā)性骨髓瘤U266細胞。收集細胞處理樣本后，檢測酸性鞘磷脂酶活性。結果顯示，聯(lián)合用藥1h，能顯著激活酸性鞘磷脂酶活性（見插頁圖5）。上述結果說明單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮聯(lián)合用藥能夠激活多發(fā)性骨髓瘤U266細胞的酸性鞘磷脂酶活性，進而促進神經(jīng)酰胺的生成。

圖5 隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用活化U266細胞酸性鞘磷脂酶

2.6 脂筏抑制劑Filipin能夠干預單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮誘導的多發(fā)性骨髓瘤U266細胞凋亡標記蛋白的剪切活化 空白對照組，聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin組（脂筏抑制劑Filipin1μg/mL預處理 2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分別作用于對數(shù)生長期的多發(fā)性骨髓瘤U266細胞24h后，收集細胞提取細胞總蛋白Western Blot法檢測 cleaved-Parp，cleaved-Caspase3凋亡蛋白活化情況，結果顯示，脂筏抑制劑Filipin能夠抑制凋亡蛋白cleaved-Parp，cleaved-Caspase3活化水平（見插頁圖6）。

圖6 脂筏抑制劑Filipin干預隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸誘導多發(fā)性骨髓瘤U266細胞凋亡的作用效應

2.7 脂筏抑制劑Filipin能夠干預單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮引起的脂筏聚集 空白對照組，聯(lián)合用藥組（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin組（脂筏抑制劑Filipin1μg/mL預處理2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分別作用于對數(shù)生長期的多發(fā)性骨髓瘤U266細胞3h后，收集處理樣本，激光共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示，聯(lián)合用藥后多發(fā)性骨髓瘤U266細胞膜上熒光強度增加，加入Filipin后熒光強度較聯(lián)合用藥減少。上述結果說明脂筏抑制劑Filipin能夠抑制聯(lián)合用藥引起的脂筏在細胞膜上的聚集（見插頁圖7）。

圖7 脂筏抑制劑Filipin能夠干預單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮引起的脂筏聚集

3 討論

已有文獻報道，As2O3可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖及誘導其凋亡發(fā)生，研究結果顯示，As2O3引起MM細胞線粒體膜電位發(fā)生變化，增大線粒體內膜通透性促進細胞色素C的釋放激活Caspase家族蛋白誘導細胞凋亡發(fā)生[8-9]。MMAIII是中藥砒霜As2O3在體內的活性代謝產物，其生物學活性遠強于后者。As2O3進入人體后迅速在肝臟砷甲基轉移酶的作用下轉化為有機形態(tài)的活性代謝產物單甲基亞砷酸[10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)MMAIII能夠促進線粒體細胞色素C的釋放誘導小鼠肝細胞凋亡發(fā)生。Chen等[12]報道，有機活性代謝產物MMAIII抗白血病和淋巴瘤細胞活性明顯強于無機形態(tài)的As2O3，且對正常骨髓組織無毒副作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮（CPT）聯(lián)合As2O3協(xié)同作用于多發(fā)性骨髓瘤U266細胞較單藥作用具有更加顯著的促凋亡效應[13]，在此基礎上本課題組進一步探究As2O3活性代謝產物單甲基亞砷酸聯(lián)合隱丹參酮的協(xié)同作用效果。

神經(jīng)酰胺是重要的生物活性鞘脂類，作為第二信使廣泛參與細胞信號轉導[14-15]，在促進和調節(jié)許多包括細胞凋亡、分化、衰老等細胞過程中扮演著重要的角色[16-19]。有研究表明，這種調節(jié)作用與細胞膜上的神經(jīng)酰胺，尤其與脂筏密切相關[20]。脂筏是一種筏狀的膜結構域，由鞘磷脂及膽固醇聚集形成。膽固醇填充在鞘磷脂雙層中的疏水空間內形成這種更緊湊的微區(qū)膜結構[21]。研究證實，脂筏在細胞信號跨膜轉導中發(fā)揮著重要作用。大量受體分子或刺激分子可以引起酸性鞘磷脂酶（ASMase）的激活導致神經(jīng)酰胺的釋放，促使細胞膜上小的無活性的脂筏逐漸形成大的有活性的富含神經(jīng)酰胺的平臺結構，使得受體等信號分子跨膜轉導[21-23]。脂筏抑制劑Filipin能夠破壞脂筏的結構，阻止富含神經(jīng)酰胺的脂筏平臺形成，抑制信號的跨膜轉導效應[24-25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用能夠活化多發(fā)性骨髓瘤U266細胞酸性鞘磷脂酶活性，促進細胞膜上神經(jīng)酰胺生成，迫使細胞膜上脂筏增大。聯(lián)合用藥1h能夠顯著活化U266細胞酸性鞘磷脂酶活性，聯(lián)合用藥2h能夠促進U266細胞膜上神經(jīng)酰胺的生成，酸性鞘磷脂酶的活化早于神經(jīng)酰胺的生成，隨著細胞膜上神經(jīng)酰胺的增多脂筏不斷的形成增大，并且下游凋亡蛋白的表達被激活。

綜上所述，本研究得出隱丹參酮聯(lián)合單甲基亞砷酸協(xié)同作用能夠上調多發(fā)性骨髓瘤U266細胞酸性鞘磷脂的活性，促進細胞膜上鞘磷脂水解生成神經(jīng)酰胺，進一步形成富集神經(jīng)酰胺的脂筏并激活U266細胞下游凋亡信號通路。本研究結果表明，隱丹參酮聯(lián)合MMAIII具有協(xié)同抗MM作用，有望為MM的臨床治療帶來新思路。