氟西汀和帕羅西汀對斑馬魚腦組織5-HT能神經(jīng)傳導系統(tǒng)的影響

陳 瑜，張 博，李鐵軍

(浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

抑郁癥作為常見精神疾病，是現(xiàn)代社會中常見且致殘率極高的精神疾病。抑郁癥在全球的發(fā)病率可達5%～12%，隨著社會的發(fā)展，抑郁癥的發(fā)病率仍然不斷上升，根據(jù)國際衛(wèi)生組織(WHO)相關(guān)報道，抑郁癥已經(jīng)成為影響人體健康的主要疾病，其影響性僅次于心臟疾病[1]。5-HT (serotonin)，以色氨酸為前體合成，數(shù)目相對較少，在情緒、情感和睡眠中有重要作用。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs) 可選擇性地抑制突觸前膜對5-羥色胺的回收，增加5-HT 在突觸間隙的積累與突觸后神經(jīng)元的興奮性，能改善抑郁癥狀[2]。

人類排泄、未使用或過期而直接丟棄的SSRIs 藥物通過衛(wèi)生間等管道系統(tǒng)進入生活廢水，并進入環(huán)境水體中，在歐洲和北美，據(jù)統(tǒng)計每年藥物產(chǎn)品以ty-1以上的排量通過污水處理廠的處理廢水釋放到地表水中[3]。氟西汀和帕羅西汀口服吸收迅速，半衰期較長，消除慢，其主要代謝產(chǎn)物的半衰期更長[4]。由此導致其可長時間存在于環(huán)境中，造成水體污染。雖然抗抑郁類藥物在環(huán)境中的濃度較低，但由于其較高的靶向生物活性和難以被水中微生物降解的特性，其藥物活性成分在水體中的痕量污染仍然會對水生態(tài)系統(tǒng)中的水生生物和人類健康造成潛在的威脅[5]。根據(jù)MINGUEZ，et al[6]的研究，舍曲林、氯米帕明、阿米替林、氟西汀等常見的八種抗抑郁藥的預測環(huán)境濃度(PEC)都高于10 ng·L-1，超過了歐盟國家認定的最低環(huán)境風險評估標準。近年來國際上對于抗抑郁藥這類新興污染物的研究逐漸增多，但在我國的研究仍處于起步階段[7]。斑馬魚作為一種模式生物，常用于環(huán)境監(jiān)測，并且和人類基因有著高度的同源性。5-HT1A 受體是5-羥色胺系統(tǒng)神經(jīng)傳遞的重要調(diào)節(jié)因素之一[8]。5-HT1A 受體與抑郁癥關(guān)系密切，且高通量的5-HT1A 受體激活劑可以改善抑郁與癲癇癥狀[9]。5-HT 轉(zhuǎn)運體(serotonin transporter，SERT)是選擇5-HT 再攝取抑制劑的作用靶點。SERT 廣泛存在于大腦邊緣系統(tǒng)，有研究表明SERT 的mRNA 的分布情況與5-HT 的陽性免疫反應(yīng)神經(jīng)細胞是一致的[10-11]。

本研究采用斑馬魚作為目標生物，探討水體中氟西汀和帕羅西汀暴露后斑馬魚腦組織中5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)關(guān)鍵功能性分子蛋白5-HT1A 受體和SERT 水平的變化情況，了解SSRI 類抗抑郁藥物對斑馬魚腦組織中5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)的影響，為進一步研究SSRI 類抗抑郁藥物對斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良影響提供科學依據(jù)，為研究其他藥物對水生生物的健康損害效應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物

斑馬魚由武漢國家斑馬魚資源中心提供。將自來水曝氣除氯后備用。100 尾成年斑馬魚分別置于含有4 L 純凈水的5 L 燒杯中，每個燒杯中25 尾魚。室溫和水溫控制在28℃左右，光照自動控制(光照時間08:00-18:00)，分別于早晚各喂食1 次。適應(yīng)環(huán)境10 d 后進行染毒。

1.2 試劑

氟西汀和帕羅西汀購置于Sigma-Aldrich 公司。

動物RNA 抽提試劑盒(R0026)，cDNA 第一鏈合成試劑盒(D7168M)，SYBR Green qPCR Mix(D7265)，NA-Red 2000X(D0128)，AGarose(ST004L)，DNA 上樣緩沖液6X(D0071)，TBE(ST720)，PBS(500 mL)，DEPC水(100 mL)。細胞蛋白抽提試劑盒(P0033)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(P0012A)，Western Breeze 試劑盒(Invitrogen WB7103，WB7105，WB7107)，彩色預染蛋白質(zhì)分子量標準(P0068)，SDS-PAGE 電泳液10X(P0014C)，PMSF(ST506)，Western 半干法轉(zhuǎn)膜液(P0021C)，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液5X(P0015)，GAPDH Rabbit Monoclonal Antibody(AF1186)，PVDF 膜(FFP24)，BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(C3206)，以上試劑購于上海碧云天生物試劑有限公司。β-actin、5-HT1A 受體、SERT 引物(1.0OD*2)，DNA 分子量標準Ladder H2 (50-1031bp，B500345)，購于上海生工生物工程公司。5-HT Transporter Antibody，購于美國IMMUNOSTAR 生物試劑公司。

1.3 儀器

離心機(Eppendorf5424R)，勻漿器(TIANGEN，ose-y30)，QPCR 儀(Applied Biosystems StepOnePlus)，PCR儀(Applied Biosystems 2720)，酶標儀(Thermo Multiskan FC)，超微量分光光度計(Thermo Scientific NanoDrop 2000C)，瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一，DYCP-31DN)，凝膠成像系統(tǒng)(170-8170 Bio-rad)，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(北京六一，DYY-8C)，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD Trans-Blot SD 170-3940)。

1.4 動物分組與藥物處理

將100 條斑馬魚分為4 組，分別是氟西汀組，帕羅西汀組，氟西汀和帕羅西汀混合組，空白對照組4組，每組25 尾。其中氟西汀組染毒劑量為100 ng·L-1，帕羅西汀組染毒劑量為100 ng·L-1，氟西汀和帕羅西汀混合組兩種藥物濃度分別為100 ng·L-1[12-13]。分別于染毒后第7 天和第14 天進行實驗。

1.5 實時熒光定量PCR

于染毒第7 天和第14 天分別于各組中取6 條魚，收集腦組織于離心管中，利用mRNA 提取試劑盒提取腦組織中的mRNA，并于提取后通過酶標儀測定mRNA 濃度。

測定完成后馬上進行逆轉(zhuǎn)錄，使用cDNA 第一鏈合成試劑盒對5-HT1A 受體和SERT 基因進行逆轉(zhuǎn)錄，引物序列如表1[14-15]，反應(yīng)體系如表2。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 逆轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件Tab.2 Reverse transcription system and reaction conditions

轉(zhuǎn)錄完成后的cDNA 產(chǎn)物存于4℃冰箱中。實驗前使用PBS 對cDNA 樣品進行50 倍的稀釋后進行qPCR 實驗(表3)。采用2-△△CT法計算5-HT1A 受體和SERT 基因的相對表達量。

對qPCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。使用瓊脂糖凝膠試劑盒制作3%的凝膠，對2 個時期、4 組共8 個樣品各上樣5 μL 后設(shè)置電壓120 V，時間40 min，通過凝膠成像儀進行觀察。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

于染毒第7 天和第14 天于分別于各組中取6 條魚，收集腦組織于離心管中，使用蛋白抽提試劑盒進行腦組織蛋白提取。提取后立即使用BCA 法蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定，繪制標準曲線。測定完成后100℃變性5 min 后，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

表3 實時熒光定量PCR 體系及反應(yīng)條件Tab.3 Real-time PCR system and reaction conditions

使用SDS-PAGE 制膠試劑盒配置8%的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠和分離膠比例為1:3，上樣前在蛋白質(zhì)樣品中加入蛋白上樣緩沖液，上樣量20 μL。濃縮膠100 V 40 min，分離膠120 V 120 min。待溴酚藍遷移到凝膠底部停止電泳。取出凝膠并裁好適合大小的PVDF 膜及兩塊厚濾紙，制成三明治夾層，使用半干轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜。恒流1.5 mA·cm-2，轉(zhuǎn)膜25 min。取出膜后封閉1 h，一抗(5-HT Transporter Antibody，GAPDH Rabbit Monoclonal Anitibody，濃度1:2 000) 4℃孵育過夜，二抗(Western Breeze 試劑盒，Secondary Antibody Solution)稀釋1 倍后室溫孵育1 h，最后利用堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。通過Image J 軟件分析灰度，進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計分析

對qPCR 和Western Blot 結(jié)果利用SPSS 20.0 軟件進行雙因素方差分析，相對表達量用平均數(shù)±標準差來表示，SERT 蛋白相對GAPDH 蛋白含量用平均數(shù)±標準差來表示，P＜0.05 認定為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 qPCR 結(jié)果

酶標儀測定樣品結(jié)果260/280 為1.95～1.99。圖1，圖2 分別為染毒7 d 及14 d 氟西汀組，帕羅西汀組，氟西汀和帕羅西汀混合組以及空白對照組4 組的5-HT1A，SERT，β-actin3 個基因的qPCR 擴增曲線和熔解曲線。

圖1 染毒7 d qPCR 的擴增曲線(左)和熔解曲線(右)Fig.1 Amplification curve (left) and melting curve (right) of qPCR at 7 days after exposure

圖2 染毒14 d qPCR 的擴增曲線(左)和熔解曲線(右)Fig.2 Amplification curve (left) and melting curve (right)of qPCR at 14 days after exposure

統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，天數(shù)主效應(yīng)(P＜0.05)和藥物主效應(yīng)(P＜0.01)均具有統(tǒng)計學意義(表4)。染毒14 d 時5-HT1A 轉(zhuǎn)錄水平相對染毒7 d 時升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。氟西汀組5-HT1A 轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，帕羅西汀組5-HT1A 轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?；旌辖M5-HT1A 轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。氟西汀組5-HT1A 轉(zhuǎn)錄水平高于帕羅西汀組和混合組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

染毒14 d 時SERT 轉(zhuǎn)錄水平相對染毒7 d 時升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。氟西汀組SERT 轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，帕羅西汀組SERT 轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?；旌辖MSERT 轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。氟西汀組SERT轉(zhuǎn)錄水平高于帕羅西汀組和混合組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表4 5-HT1A 及SERT 相對表達量(x±s,n=3)Tab.4 Relative expression levels of 5-HT1A and SERT (x±s,n=3)

圖3 染毒7 d 時瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results after seven days of exposure

圖4 染毒14 d 時瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis results after fourteen days of exposure

2.2 Western blot 結(jié)果

BCA 法測定蛋白濃度結(jié)果，7 d 蛋白濃度標準曲線如圖5，R2=0.991 7。氟西汀組、帕羅西汀組、混合組和空白組蛋白濃度分別為3.22 μg·μL-1、3.43 μg·μL-1、3.50 μg·μL-1和3.92 μg·μL-1。14 d 蛋白濃度標準曲線如圖6，R2=0.992 0。氟西汀組、帕羅西汀組、混合組和空白組蛋白濃度分別為3.10 μg·μL-1、3.28 μg·μL-1、3.49 μg·μL-1和4.01 μg·μL-1。

圖5 染毒7 d 時蛋白標準曲線Fig.5 Protein standard curve at 7 days of exposure

圖6 染毒14 d 時蛋白標準曲線Fig.6 Protein standard curve at 14 days of exposure

Western Blot 結(jié)果如圖7。統(tǒng)計分析分析結(jié)果顯示，天數(shù)主效應(yīng)(P＜0.05)，藥物主效應(yīng)(P＜0.01)均具有統(tǒng)計學意義(表5)。染毒14 d 時SERT 蛋白表達水平相對染毒7 d 時降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。氟西汀組和帕羅西汀組相對空白對照組斑馬魚腦組織中SERT 蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?；旌辖M與空白對照組比較SERT 蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。氟西汀組斑馬魚腦組織中SERT 蛋白表達水平相比帕羅西汀組和混合組表達水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖7 Western Blot 結(jié)果Fig.7 Western Blot results

表5 SERT 蛋白相對表達量(x±s，n=3)Tab.5 SERT protein relative expression (x±s,n=3)

3 討論

為了解SSRI 類抗抑郁藥物對斑馬魚腦組織中5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)的影響，本研究選取SSRI 類抗抑郁藥代表藥物氟西汀和帕羅西汀，探討其對斑馬魚腦組織5-HT 系統(tǒng)關(guān)鍵功能分子蛋白5-HT1A 受體和5-HT 轉(zhuǎn)運體水平的影響。5-HT 是一種分布于中樞和外周的吲哚衍生物。腦組織內(nèi)5-HT 起著神經(jīng)遞質(zhì)的作用，只占總量的2%。但是它們對認知、運動、疼痛、食欲、交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮起著重要的調(diào)節(jié)作用[16]。5-HT1A 受體是5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)突觸前膜上的重要受體之一，是在5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)中與5-HT 結(jié)合調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放并傳遞神經(jīng)信號的重要環(huán)節(jié)之一。5-HT1A 受體的相對表達量減少能對5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響[17]。5-HT 在傳遞神經(jīng)信號后必須滅活，否則可能會產(chǎn)生中毒反應(yīng)及5-HT 受體的脫敏。5-HT 必須通過載體轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)以滅活，這個過程主要依靠細胞膜上的5-HT 轉(zhuǎn)運體來完成。5-HT 能神經(jīng)元表達SERT 將5-HT 再攝取，抑制5-HT 轉(zhuǎn)運體可導致內(nèi)在初級傳入神經(jīng)元對5-HT反應(yīng)增強，影響5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)的正常工作。

本研究結(jié)果顯示，水環(huán)境中氟西汀暴露可引起斑馬魚腦組織中5-HT1A 受體基因和SERT 基因轉(zhuǎn)錄水平升高，且隨著時間的延長作用越明顯。CUNHA，et al[15]的研究結(jié)果顯示：大鼠在含有氟西汀或帕羅西汀的環(huán)境下5-HT1A 受體基因和SERT 基因的表達量都有不同程度的下降。大鼠和斑馬魚都是脊椎動物，但是大鼠是哺乳動物而斑馬魚是魚類。物種的差異可能是導致機體對藥物出現(xiàn)不同反應(yīng)的原因。在染毒7 d 時，氟西汀組5-HT1A 受體基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)明顯地升高，甚至高于染毒14 d 時5-HT1A 受體的轉(zhuǎn)錄水平。在AIRHART，et al[18]的研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露于含有氟西汀的水環(huán)境中24 h 后，其自發(fā)性游泳活動會有一個顯著下降時期，并于數(shù)天后恢復。根據(jù)姚麗艷[19]的研究表明，在人體服用氟西汀后數(shù)小時內(nèi)血藥濃度會達到峰值，并在10～14 d 達到穩(wěn)定的血藥濃度。因此，在染毒7 d 后5-HT1A 受體基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)較為明顯升高的原因可能是由于前期藥效不穩(wěn)定引起。水環(huán)境中帕羅西汀暴露同樣可以引起斑馬魚腦組織中5-HT1A 受體基因和SERT 基因轉(zhuǎn)錄水平升高。這與LIN Wanhui，et al[20]的研究結(jié)果一致。但是，同等劑量下作用效果不如氟西汀明顯。根據(jù)陸蘅等[21]的研究表明，帕羅西汀對人體的近期藥效優(yōu)于氟西汀。李培強[22]的研究表明帕羅西汀和氟西汀對人體的治療效果無明顯差異。由此可以推斷，物種不同是導致機體對藥物反應(yīng)性不同的主要原因。

研究發(fā)現(xiàn)，水環(huán)境中氟西汀暴露引起斑馬魚腦組織中SERT 蛋白的表達水平降低，帕羅西汀同樣引起SERT 蛋白表達水平降低，并且隨著時間的延長作用越明顯，這一點與劉志軍等[23]的研究結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能為轉(zhuǎn)錄水平的升高正是由于蛋白水平的降低引起，表現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)錄水平的代償性升高，以此來實現(xiàn)蛋白質(zhì)含量的降低。陳茉弦等[24]及李曉鋒[25]的研究表明，氟西汀和帕羅西汀對大鼠SERT 蛋白的表達量有明顯的抑制作用。AMADOR，et al[26]的研究也表明，氟西汀暴露可以導致斑馬魚和硬骨魚SERT蛋白表達水平下降。以上結(jié)果表明，氟西汀和帕羅西汀可以引起斑馬魚與大鼠SERT 蛋白表達水平降低。

氟西汀和帕羅西汀混合暴露引起斑馬魚腦組織中5-HT1A 受體基因和SERT 基因轉(zhuǎn)錄水平升高，但是差異無統(tǒng)計學意義。氟西汀和帕羅西汀混合暴露引起斑馬魚腦組織SERT 蛋白表達水平降低。氟西汀和帕羅西汀同屬SSRI 類抗抑郁藥物，都是通過選擇性抑制突觸前釋放的5-HT 的重吸收以增加細胞外可以和突觸后受體結(jié)合的5-HT 水平[15]。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能為氟西汀和帕羅西汀兩種藥物同時暴露時出現(xiàn)拮抗作用導致。

綜合以上結(jié)果顯示，SSRI 類抗抑郁藥物氟西汀和帕羅西汀通過引起斑馬魚腦組織中5-HT1A 受體和SERT 轉(zhuǎn)錄水平和表達水平異常，從而干擾腦組織5-HT 能神經(jīng)傳導系統(tǒng)的正常功能，進而影響斑馬魚腦組織5-HT 能系統(tǒng)的正常生理功能。本研究為進一步研究SSRI 類抗抑郁藥物對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的不良影響提供科學依據(jù)，為研究其他藥物對水生生物的健康損害效應(yīng)提供參考。