小球藻破碎率檢測方法的定量比較

秦勝男，黃遠星，穆 巖

（1.上海理工大學(xué) 環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093；2.河北省環(huán)境監(jiān)測中心站，河北 石家莊 050056）

小球藻是一類普生性單細胞綠藻，易培養(yǎng)、倍增速率快、溫度耐受性強、油脂含量較高［1-2］，具有非常高的利用價值。目前，其油脂可作為生物柴油的原料［3-5］，同時還可提取其他多種有效成分，比如生長因子CGF（chlorella growth factor）。小球藻富含維生素，可作為生產(chǎn)維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B6和維生素C等的來源［6］。它也是進行生物技術(shù)研究的材料，其多糖與蛋白質(zhì)已被證明具有顯著的抗腫瘤活性、抗原病菌以及抗病毒感染能力［7］。

但小球藻具有堅韌的纖維素細胞壁［8］，無論是提取油脂或是胞內(nèi)蛋白等，都需要采用破碎方法將細胞壁破碎，而在破碎過程中需檢測小球藻破碎率來表征破碎程度，因此，選擇操作簡便、測量精準的破碎率檢測方法尤為重要。

光密度法是利用藻細胞在某一波長處的光吸收值來測定細胞密度的方法［9］，同時超聲波破碎后的藻液亦可用丙酮提取比色法來測定懸濁液中的葉綠素含量［10］。細胞計數(shù)法是定量分析中較為可靠的方法［11］，但其操作過程較為繁瑣，且若取量不均，或樣品中的細胞濃度過低時，容易造成一定程度的誤差［12］。

本文比較了濁度法、吸光度法、細胞計數(shù)法和紫外分光光度法檢測破碎率的可行性，為優(yōu)化定量比較小球藻破碎率的方法提供了參考與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗用小球藻藻種（FACHB編號752）由武漢中科院水生所藻種庫購得。

BG-11 培養(yǎng)基［13］：硝酸鈉（1.5 g·L-1），磷酸氫二鉀（0.04 g·L-1），硫酸鎂（0.075 g·L-1），二水氯化鈣（0.036 g·L-1），檸檬酸（0.006 g·L-1），檸檬酸鐵銨（0.006 g·L-1），乙二胺四乙酸（0.001 g·L-1），碳酸鈉 （0.02 g·L-1），微量元素母液（1 mL·L-1）：硼酸（2.86 g·L-1），四水合氯化錳（1.86 g·L-1），七水硫酸鋅（0.22 g·L-1），二水鉬酸鈉（0.39 g·L-1），五水硫酸銅 （0.08 g·L-1），六水硝酸鈷（0.05 g·L-1）。

實驗用儀器：賽福PGX-350B智能培養(yǎng)箱，JYD-1200L超聲波細胞粉碎機，CT14D離心分離機，2100p濁度儀，723N可見分光光度計，TV-1810紫外分光光度計，Bright-Line細胞計數(shù)板（HAUSSER SCIENTIFIC公司），光學(xué)顯微鏡（DME），LGJ-10D真空冷凍干燥機，日立S4800掃描電子顯微鏡。

1.2 小球藻的計數(shù)

采用四種計數(shù)方法對小球藻破碎前、后進行定量測定：

（1）濁度法：測定藻液濁度［14］。

（2）吸光度法：分別在波長為540、680 nm下測定藻液吸光度［15］。

（3）細胞計數(shù)法：使用細胞計數(shù)板對藻液中的小球藻進行直接計數(shù)［12］。

（4）紫外分光光度法：將藻液進行轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1、時間為 20 min 的離心操作。取上層清液，在260 nm下測定其紫外分光光度［16］。

采用每種方法對每個樣品測定3次，取平均值。

1.3 小球藻的培養(yǎng)

小球藻采用逐級放大法進行培養(yǎng)。先將小球藻藻種與BG-11培養(yǎng)基按照體積比1:5培養(yǎng)兩周，然后將所得藻液與BG-11培養(yǎng)基按照體積比1:5再培養(yǎng)兩周，最后將所得全部藻液與BG-11繼續(xù)按照體積比1:5進行培養(yǎng)。在第三次放大培養(yǎng)后，每24 h測量一次小球藻藻液濁度、540 nm吸光度與細胞計數(shù)。整個培養(yǎng)過程在賽福PGX-350B智能培養(yǎng)箱中進行，溫度為25℃，光照度為 5 000 lx，光暗時間各 12 h。

1.4 小球藻的破碎

取200 mL藻液置于超聲波細胞粉碎機中，將探頭深入液面以下5 cm進行破碎。超聲破碎條件為：破碎時間為5 s，間歇時間為5 s，兩者交替進行。在超聲功率分別為360、540、720、1 080 W 時，分別進行 5、10、30、60 min 的破碎。

1.5 小球藻的掃描電鏡觀察

先將小球藻藻液置于真空冷凍干燥箱中在- 28 ℃ 冷凍 4 h，再真空干燥 72 h，然后利用日立S4800掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

細胞計數(shù)法、吸光度法和濁度法的數(shù)據(jù)處理：取未被超聲破碎前的初始值為xi，實驗中所測到的最小值為xmin（對應(yīng)最高的破碎水平）。細胞計數(shù)法的最小值取零，吸光度法和濁度法則取被檢測到所有數(shù)據(jù)中的最小值。時間t時濁度法、吸光度法和細胞計數(shù)法檢測出的數(shù)據(jù)為xt，Xt則代表在該時間條件下細胞的破碎率［11］，有

紫外分光光度法的數(shù)據(jù)處理：為了與其他檢測方法進行對比，以ymax代表溶液內(nèi)檢測出的有機物的最大值，yi代表超聲破碎前的初始有機物的濃度，yt代表時間t時溶液內(nèi)檢測出的有機物的濃度［11］，則有

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻生長曲線

圖1 三種方法檢測得到的小球藻生長曲線Fig.1 Growth curves of Chlorella vulgaris detected by turbidity, 540 nm absorbance and cell counting

在進行超聲波破碎前需對小球藻藻液進行培養(yǎng)。實驗用藻種在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，在最后一次擴大培養(yǎng)后開始檢測，每隔24 h進行取樣，分別測量其濁度、540 nm吸光度和細胞密度，結(jié)果如圖1所示。從圖中可看出，藻細胞密度隨時間增加而增長，三種方法檢測得到的生長曲線較為吻合，表明這三種方法均可較準確地測定溶液中完整的藻細胞密度。黃美玲等［17］證明藻液吸光度與單位體積下細胞數(shù)量存在良好的線性關(guān)系，光密度法能快速且較為精準地測定小球藻生物量。濁度法和吸光度法的測量結(jié)果標(biāo)準偏差非常小。而細胞計數(shù)法由于是人工操作，產(chǎn)生了較大的標(biāo)準偏差，但大都小于10%，說明該方法具有一定的可靠性。藻細胞密度經(jīng)過30 d的培養(yǎng)達到 9.5 × 106個·mL-1，滿足實驗要求，可進行超聲波破碎。

2.2 四種方法檢測小球藻破碎情況

濁度法在此前被認為是一種較為粗略的檢測小球藻破碎率的方法［11］，其操作簡便，且無需對超聲破碎后的樣品進行進一步處理，直接檢測即可。

圖2為濁度法，540、680 nm吸光度法，細胞計數(shù)法和紫外分光光度法檢測的小球藻破碎情況。在超聲功率為360 W時，濁度法、540 nm吸光度法、細胞計數(shù)法和紫外分光光度法的檢測結(jié)果呈現(xiàn)同樣的規(guī)律，溶液內(nèi)的細胞破碎率均隨著超聲破碎時間的增加而增加。除了680 nm吸光度法檢測到的破碎率在30 min時略有下降外，總體來說四種方法檢測出的結(jié)果變化趨勢一致。由于藻液總體破碎率低，在60 min時，細胞計數(shù)法所測得的細胞破碎率為18.3%，溶液內(nèi)的細胞碎片沒有大幅增多，細胞內(nèi)流出物較少，與原始藻液相比，溶液內(nèi)的小球藻密度、體積及形態(tài)變化較小。同時也說明，這四種方法在低功率破碎時，雖難以測出具體破碎率，但破碎趨勢具有一定的規(guī)律性。而在超聲功率分別為540、720和1 080 W時，濁度法檢測出的溶液內(nèi)細胞破碎率隨著時間的增加呈先上升后下降的趨勢。究其原因，可能是藻液在中高功率超聲破碎下，溶液內(nèi)的細胞碎片大大增加，又因水的濁度不僅與水中存在的顆粒物含量有關(guān)，而且和其粒徑、形狀、顆粒表面對光散射特性都有密切關(guān)系［14］。所以，藻液內(nèi)大量的細胞碎片可能會干擾所測濁度數(shù)據(jù)。隨著細胞碎片的大幅增多，檢測出的溶液內(nèi)細胞破碎率反而減小。綜上所述，在超聲功率大于540 W時，濁度法檢測小球藻破碎率的結(jié)果存在一定的不確定性。

圖2 濁度法、540 nm/680 nm吸光度法、細胞計數(shù)法和紫外分光光度法檢測的小球藻破碎情況Fig.2 Cell rupture of chlorella vulgaris detected by turbidity, 540 nm/680 nm absorbance, cell counting and UV absorbance

540、680 nm吸光度法和紫外分光光度法都屬于光密度法，通過測定細胞懸液或溶液的吸光值來間接測定生物量，具有快速、簡便的特點，但細胞的形態(tài)、組分及光學(xué)性質(zhì)的變化可能會導(dǎo)致誤差的產(chǎn)生［18］。經(jīng)過超聲波破碎后，小球藻內(nèi)的物質(zhì)由細胞內(nèi)流入周圍溶液中，由于超聲波破碎過程中易產(chǎn)生局部高溫現(xiàn)象，造成熱敏性活性物質(zhì)失活［19］，從而導(dǎo)致流出物的物理或化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，而不同物質(zhì)的吸收光譜不同。由圖2（b）、（c）對比看出，680 nm 吸光度法稍優(yōu)于540 nm吸光度法，說明680 nm吸光度法在間接檢測小球藻破碎率上具有較高的準確性。

國內(nèi)外學(xué)者在檢測小球藻密度時多使用細胞計數(shù)法［20-22］。當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛、操作比較方便的細胞計數(shù)法是細胞儀計數(shù)［22］，但其無法對細胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)特征進行研究［23］，也無法確定環(huán)境中的樣品是完整細胞還是細胞碎片。所以本文采用細胞計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下對小球藻進行人工直接計數(shù)［15］。

從圖2（d）中可看出，在同一超聲功率時，溶液內(nèi)的細胞破碎率隨時間增加逐步遞增，而在同一時間下，除了超聲功率在540、720 W時，兩者破碎率較為接近外，溶液內(nèi)總體細胞破碎率隨著功率的增大逐步遞增。在超聲功率為360 W時，從10 min至60 min，細胞計數(shù)法檢測出小球藻破碎率由15.7%增至18.3%，而在超聲功率為 1 080 W 時，從 5 min 至 60 min，細胞破碎率由26.2%增至83.9%。這說明功率是影響破碎率的重要因素之一。分析認為，超聲功率為540、720 W時破碎率接近是因為兩者功率相差不大，且細胞計數(shù)法具有一定的誤差性，所以可以認為細胞計數(shù)法是一種檢測小球藻細胞破碎率較為可靠的方法。

紫外分光光度作為有機物的替代指標(biāo)，兩者之間具有良好的線性關(guān)系［16］。從圖2（d）、（e）的對比可看出，紫外分光光度法和細胞計數(shù)法的檢測結(jié)果具有非常相似的逐步遞增趨勢，呈現(xiàn)出同樣的規(guī)律，但兩者檢測出的細胞破碎率不一致，所以，紫外分光光度法檢測小球藻破碎率雖較為理想，卻無法檢測出具體破碎率。鑒于紫外分光光度法比細胞計數(shù)法更為簡便與快捷，因此對測量小球藻破碎率具有一定的可參考價值。

2.3 三種檢測方法與細胞計數(shù)法的對比分析

圖3給出了三種檢測方法與細胞計數(shù)法的對比。圖中，點［0，0］代表未破碎的懸浮藻液，［1，1］代表完全破碎后的藻液。因為細胞計數(shù)法是能直接、可靠測量出小球藻破碎率的方法，為了進一步分析濁度法、紫外分光光度法與吸光度法檢測結(jié)果作為細胞破碎率指標(biāo)的一致性，將標(biāo)準化后的數(shù)據(jù)與細胞計數(shù)法結(jié)果在圖3中繪出［11］。圖3顯示，680 nm吸光度法測得的數(shù)據(jù)大致落在細胞計數(shù)線的兩側(cè)，尤其是在破碎率較低時，兩者十分接近。這說明680 nm吸光度法所表征出的破碎率遵循和細胞計數(shù)法的相似的規(guī)律。540 nm吸光度法測得的數(shù)據(jù)在低破碎率時均勻地分布于直線上方，與細胞計數(shù)法保持一定的相似性。但在中高破碎率時，兩者相差較大，無明顯規(guī)律。濁度法用來檢測小球藻破碎率數(shù)據(jù)不佳，由于超聲波破碎后，溶液內(nèi)增加了大量的細胞碎片，檢測出的細胞破碎率均偏大。紫外分光光度法檢測出的細胞破碎率均分布于細胞計數(shù)直線上方，與直線保持一致的趨勢，說明紫外分光光度法測出的具體破碎率普遍大于細胞計數(shù)法測出的。所以需謹慎運用紫外分光光度法檢測小球藻的破碎率。

圖3 三種檢測方法與細胞計數(shù)法的對比Fig.3 Comparison among the turbidity, 540 nm/680 nm absorbance, UV absorbance and cell counting for cell rupture detection of Chlorella vulgaris

2.4 不同破碎條件下掃描電鏡圖片分析

為了進一步了解超聲波的破碎機理，實驗選取了未經(jīng)破碎處理，破碎超聲功率為1 080 W、破碎時間分別為5、60 min的小球藻，用掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。圖4為超聲波破碎小球藻細胞的電鏡圖片。從圖中可看出，未經(jīng)超聲波破碎處理的小球藻表面光滑平整，呈球形結(jié)構(gòu)。超聲功率為 1 080 W，破碎時間為 5 min 的小球藻顆粒邊緣出現(xiàn)很多細裂紋，而破碎時間為60 min的小球藻顆粒表面凹凸不平，出現(xiàn)非常多的褶皺，且細胞中間出現(xiàn)空洞。

超聲波是一種彈性機械振動波，它能產(chǎn)生強烈的空化效應(yīng)、高加速度、擊碎和攪拌作用等多種效應(yīng)，使提取介質(zhì)中的微小氣泡壓縮、爆裂，加速溶劑穿透，從而使藻細胞壁破碎，加速有效物質(zhì)的溶出［24］。在相同超聲功率下，破碎5 min的小球藻細胞壁被空化汽泡擊出裂紋，細胞壁的致密結(jié)構(gòu)遭到破壞，而破碎60 min時，小球藻的細胞壁被空化氣泡擊碎，出現(xiàn)空洞，細胞內(nèi)的有效物質(zhì)溶出，且細胞表面由于空化氣泡的來回撞擊，產(chǎn)生變形，呈現(xiàn)出圖4所示的結(jié)構(gòu)。

圖4 超聲波破碎小球藻細胞的電鏡圖片F(xiàn)ig.4 SEM pictures of Chlorella vulgaris ruptured by ultrasonic

3 結(jié) 論

本文比較了四種檢測小球藻破碎率的方法，為定量檢測超聲波法破碎小球藻的破碎率提供了依據(jù)。細胞計數(shù)法無論是測定小球藻破碎趨勢，還是測定其破碎率，都是較為理想的檢測方法。紫外分光光度法與細胞計數(shù)法的檢測結(jié)果高度一致，可以大致推測小球藻的破碎情況，但難以得到具體的破碎率。680 nm吸光度法在同一超聲功率時，隨著時間的增加，檢測結(jié)果具有一定的規(guī)律，在檢測小球藻破碎率時具有一定的參考性。在較大功率的超聲波破碎下，濁度法用于檢測小球藻破碎率存在一定的不確定性。通過掃描電鏡可觀察到，超聲波通過空化汽泡擊穿小球藻細胞壁，形成空洞，使有效物質(zhì)溶出，并使細胞表面產(chǎn)生變形。