豇豆枯萎病拮抗木霉MA4菌株的分離與鑒定

申君 楊紹麗 吳仁鋒

摘要：為篩選能有效抑制豇豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum）的生防真菌，采用平板稀釋法和平板對(duì)峙法從武漢設(shè)施蔬菜根際土壤中分離、純化、篩選出一株優(yōu)勢(shì)拮抗真菌MA4，根據(jù)形態(tài)學(xué)和菌株18S rDNA序列對(duì)MA4菌株進(jìn)行鑒定，采用平板對(duì)峙法對(duì)其抑菌活性和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)。結(jié)果表明，MA4對(duì)豇豆枯萎病菌的抑制率為75.69%;根據(jù)其形態(tài)學(xué)鑒定和18S rDNA序列分析，確定MA4菌株為哈茨木霉（Trichoderma harzianum），將該序列在GenBank中進(jìn)行注冊(cè)登錄，登錄號(hào)為MH539514。MA4菌株對(duì)番茄灰霉病菌、辣椒根腐病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、茄子褐紋病菌、番茄早疫病菌、茄子爛稈病菌和番茄果腐病菌等8種病原菌均具有良好的抑制作用，抑制率為62.12%～86.93%;MA4菌株經(jīng)10代繼代培養(yǎng)后，對(duì)豇豆枯萎病菌的抑制率仍為80.86%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種14 d后施加MA4發(fā)酵液的處理病情指數(shù)為11.85%，防效達(dá)85.75%，且對(duì)豇豆植株具有一定促生作用。

關(guān)鍵詞：豇豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum）; 分離與鑒定; 拮抗菌; 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.43? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）02-0079-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.018? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

豇豆[Vigna unguiculata （L.） Walp.]是一種世界性的豆科蔬菜，主要分布在溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]，在中國(guó)各地均有種植。豇豆枯萎病是由半知菌亞門(mén)真菌尖孢鐮刀菌嗜導(dǎo)管專(zhuān)化型（Fusarium oxsyporum schl. f. sp. tracheiphlium，F(xiàn)OT）侵染引起的一種毀滅性土傳病害[2]，在高溫高濕條件下，可導(dǎo)致豇豆減產(chǎn)70%左右[3]。

目前，防治豇豆枯萎病主要是采用化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大量使用導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境破壞、次要病害猖獗、蔬菜農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問(wèn)題，直接影響了蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。因此，分布廣、繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng)、抗菌譜廣且能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的生防真菌-木霉菌（Trichoderma spp.）成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。木霉菌是一種廣譜的拮抗菌，至少對(duì)18個(gè)屬中的29種植物病原菌具有拮抗作用，尤其對(duì)立枯絲核菌、鐮刀菌、疫霉菌等引起的土傳病害具有較好的防治效果[5]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)木霉菌在水稻枯萎病、香蕉枯萎病、草莓根腐病、玉米立枯絲核菌等土傳病害上均有較好的抑制效果[5-9]，此外，木霉菌在黃瓜、苦瓜等蔬菜病害上有很好的防效，研究發(fā)現(xiàn)猥木霉（Trichoderma erinaceum）對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率達(dá)到79.04%，盆栽防效高達(dá)87.5%[10];深綠木霉（Trichoderma atroviride）T52和平菇木霉（Trichoderma pleurotum）32080對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制率分別為86.3%和79.0%，其盆栽防效均超過(guò)60%[11];哈茨木霉菌對(duì)苦瓜葉斑病原菌鏈格孢屬菌絲的生長(zhǎng)具有抑制作用，其抑制率為70.4%～88.1%[12]。

目前，從設(shè)施蔬菜根際土壤中篩選豇豆枯萎病拮抗真菌的報(bào)道較少。本研究從武漢設(shè)施蔬菜根際土壤中篩選到一株對(duì)豇豆枯萎病菌具有較好防效的拮抗木霉菌MA4，對(duì)其進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其抑菌譜和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其防效，以期為設(shè)施蔬菜的生物防治提供新的微生物資源。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試菌株：豇豆枯萎病菌、番茄果腐病菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子爛稈病菌（Phomopsis vexans）、茄子褐紋病菌（Phomopsis vexans）、辣椒根腐病菌（Fusorium oxysporum Schlecht）和黃瓜枯萎病菌（Fusorium oxysporum f. sp. cucumerinum）均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，番茄早疫病菌（Alternaria sonali）和西瓜枯萎病菌（Fusorium oxysporum f. sp. niveum）由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院惠贈(zèng)。

馬丁氏培養(yǎng)基（MA）：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉紅0.03 g、瓊脂20 g、加去離子水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。使用時(shí)每毫升培養(yǎng)基中加入30 μg鏈霉素以抑制放線菌生長(zhǎng)。

固體和液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g（液體PDA則不加）、去離子水1 L，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品采集與處理? 供試9份根際土壤樣品于2017年6月在黃陂區(qū)武湖基地黃瓜、番茄、辣椒、豇豆、芹菜和紫背天葵等設(shè)施蔬菜田塊采集。樣品自然風(fēng)干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 真菌的分離? 采用平板稀釋法[13]：取土樣5 g，加無(wú)菌水45 mL，置于全溫培養(yǎng)搖床28 ℃振蕩30 min，即為濃度10-1的土樣，用無(wú)菌水依次稀釋為10-2和10-3，每個(gè)濃度取100 μL涂布于馬丁氏平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落的大小、形狀等培養(yǎng)特征，挑取不同的單菌落于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化并編號(hào)，PDA斜面4 ℃保存。

1.2.3? 拮抗菌的篩選? 拮抗菌的初篩：參照起登風(fēng)等[14]的方法，以豇豆枯萎病菌（FOT）為靶標(biāo)菌，對(duì)分離到的真菌進(jìn)行拮抗活性初篩。將FOT接種于PDA平板上培養(yǎng)5 d，用打孔器打成直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，在距中央FOT 2.5 cm處對(duì)稱接種4株上述分離純化得到的菌株，使病原菌與分離的菌株呈十字交叉排列（病原菌在十字的中央，分離所得的菌株在十字的兩端），以僅在中央接病原菌為對(duì)照，倒置于培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)5 d，記錄病原菌半徑，觀察是否有拮抗活性。3次重復(fù)。

拮抗菌的復(fù)篩：采用平板對(duì)峙法[15]對(duì)上述獲得的具有拮抗效果的真菌菌株進(jìn)行復(fù)篩。將FOT和具有拮抗效果菌株同步進(jìn)行活化5 d至菌落分布均勻，用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，分別將具有活性的菌株和病原菌同時(shí)接種在內(nèi)徑9 cm的PDA平板上，菌餅圓心相距約4.5 cm，連線經(jīng)過(guò)平板圓心;以僅接病原菌為對(duì)照。接種后的平板倒置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，測(cè)量病原菌對(duì)照菌落半徑和病原菌菌落指向拮抗菌的半徑。重復(fù)3次。按下面公式計(jì)算拮抗菌株對(duì)病原菌的抑菌率[16]。

1.2.4? 拮抗菌株形態(tài)學(xué)鑒定? 將待鑒定菌株接種到PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和顏色，5 d后制作玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態(tài)特征。

1.2.5? 拮抗菌株MA4 18S rDNA PCR擴(kuò)增和序列分析? 按OMEGA HP Fugal DNA Kit說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，選用真菌18S rDNA通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′對(duì)菌株MA4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L的引物ITS1/ITS4各1 μL、I-5TM 2X High-Fidelity Master Mix 10 μL、DNA模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;16 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的基因序列在NCBI中通過(guò)BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），用MEGA6.0.6軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和聚類(lèi)分析（Boot-strap=1 000），分析親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育。

1.2.6? 拮抗菌株MA4抑菌譜測(cè)定? 利用平板對(duì)峙法在PDA平板培養(yǎng)基上測(cè)定MA4菌株對(duì)番茄果腐病、茄子爛稈病、茄子褐紋病、辣椒根腐病、黃瓜枯萎病、草莓灰霉病、番茄早疫病和西瓜枯萎病等8種蔬菜病害病原菌的抑制作用。分別以僅接病原菌為對(duì)照，接種后的平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d，測(cè)量病原菌對(duì)照菌落半徑和病原菌落指向拮抗菌的半徑。3次重復(fù)。

1.2.7? 拮抗菌株MA4穩(wěn)定性測(cè)定? 在PDA培養(yǎng)基平板上對(duì)篩選到的MA4菌株連續(xù)進(jìn)行10代繼代培養(yǎng)，并每一代以FOT為指示菌，利用平板對(duì)峙法測(cè)定MA4菌株拮抗活性的穩(wěn)定性。

1.2.8? 拮抗菌株MA4盆栽防效測(cè)定? 將種子用55 ℃溫水浸泡30 min左右，清水清洗干凈后播種，當(dāng)幼苗長(zhǎng)齊2片真葉時(shí)拔出，抖落根部土壤，用清水沖洗干凈根系，剪去根尖部分，浸入豇豆枯萎病菌孢子懸浮液（2.0×107 CFU/mL）中30 min，再移植到花盆中，置于大棚內(nèi)培養(yǎng)。在接種病原菌7 d后做如下處理：①用MA4菌株發(fā)酵濾液灌根8 mL/株;②清水灌根8 mL/株為對(duì)照;再過(guò)7 d第1次統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，14 d第2次統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。在第1次病情統(tǒng)計(jì)結(jié)束后及時(shí)進(jìn)行第2次灌根處理。

每處理3次重復(fù)，每重復(fù)10株。按時(shí)統(tǒng)計(jì)幼苗發(fā)病情況。計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 拮抗真菌的分離及拮抗效果

利用土壤稀釋分離法從采集的9份土樣中分離純化得到真菌45株，分別將其命名為MA1～MA45。以FOT為靶標(biāo)菌，采用十字交叉法篩選出10株對(duì)FOT具有抑菌活性的拮抗菌株。采用平板對(duì)峙法對(duì)10株拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，10個(gè)菌株對(duì)FOT的抑制率均超過(guò)50%，其中，MA4菌株抑菌效果最好（表1），對(duì)FOT的抑制率為75.67%，與其他菌株相比差異顯著，且MA4菌株生長(zhǎng)速度快，4 d左右長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，豇豆枯萎病菌基本停止生長(zhǎng)。

2.2? 拮抗真菌的鑒定

2.2.1? 形態(tài)學(xué)鑒定? 在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，MA4菌株的菌落生長(zhǎng)迅速，初期菌絲呈白色卷毛狀，72 h菌絲基本長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣，繼續(xù)培養(yǎng)，菌落顏色逐漸由淺綠色變?yōu)榘稻G色，氣生菌絲多，背面呈黃綠色。分生孢子梗主分枝稍微向頂端彎曲，主分支上有2～3個(gè)次級(jí)分支;瓶梗基部明顯溢縮，頂部變細(xì)，在分生孢子梗尖端有2～5個(gè)渦狀排列或單生且與主軸呈90°夾角;分生孢子橢圓形或近球形。參照上海交通大學(xué)木霉菌菌種保藏管理中心（http：//www.china-cctc.org）對(duì)哈茨木霉菌形態(tài)分類(lèi)鑒定的描述，初步確定MA4菌株為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。

2.2.2? 分子鑒定? 利用真菌 TSl/ITS4對(duì)MA4菌株18S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)序列分析得到666 bp的片段。將獲得的序列與已在NCBI上登記的19種木霉菌的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)MA4菌株與哈茨木霉菌的相似性為99%，進(jìn)一步證明MA4菌株為哈茨木霉菌，將該序列在GenBank中進(jìn)行注冊(cè)登錄，登錄號(hào)為MH539514。

2.3? 拮抗菌株MA4菌株的抑菌譜

采用平板對(duì)峙法測(cè)定番茄灰霉病、辣椒根腐病、西瓜枯萎病、黃瓜枯萎病、茄子褐紋病、番茄早疫病等8種病原菌的抑制作用。結(jié)果（表3）表明，MA4菌株對(duì)8株供試病原菌具有不同的抑菌活性。其中對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率為86.93%，與其他病原菌之間差異顯著;對(duì)番茄果腐病菌的抑制效果相對(duì)較差，但抑制率也在60%以上。對(duì)其他6種病菌的抑制率均在70%以上。由此可見(jiàn)，MA4菌株抗菌譜較廣，抑菌效果較好。

2.4? 拮抗菌株MA4的穩(wěn)定性

利用平板對(duì)峙法連續(xù)10代測(cè)定真菌MA4對(duì)FOT的抑制作用，結(jié)果如表4所示。拮抗真菌MA4對(duì)FOT的抑制率均超過(guò)75%，表明真菌MA4具有較穩(wěn)定的拮抗活性。

2.5? 拮抗菌株MA4盆栽防治效果

采用灌根接種法測(cè)定MA4菌株（7.20×107?CFU/mL）發(fā)酵濾液對(duì)豇豆枯萎病的防治效果。結(jié)果（表5）表明，接種7 d時(shí)對(duì)照組病情指數(shù)為41.00，MA4處理組病情指數(shù)僅為0.37，而14 d時(shí)對(duì)照組病情指數(shù)高達(dá)83.14，MA4處理組病情指數(shù)為11.85，MA4處理對(duì)豇豆枯萎病菌的防治效果為85.75%，且對(duì)豇豆植株有一定促生長(zhǎng)作用。

3? 小結(jié)與討論

本研究從武漢設(shè)施蔬菜根際土壤中篩選出一株對(duì)豇豆枯萎病菌的抑制率達(dá)到75.69%的真菌菌株MA4，根據(jù)菌落形態(tài)、形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA的ITS序列分析，確定該菌株為哈茨木霉，并將該序列在GenBank中進(jìn)行注冊(cè)登錄，登錄號(hào)為MH539514。哈茨木霉是目前木霉屬中研究較多且潛力較大的生防菌，適應(yīng)性好，生長(zhǎng)范圍廣，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、分泌抗生物質(zhì)等途徑對(duì)病原菌產(chǎn)生作用，對(duì)黃瓜灰霉病、白粉病、葉霉病、菌核病、霜霉病、玉米立枯病、香蕉枯萎病、苦瓜葉斑病、棉花枯萎病、棉花黃萎病、黃瓜枯萎病、小麥根腐病、草莓根腐病等均有顯著防效[7-9，12，17-21]。

生防菌是植物病害防治的主要趨勢(shì)，但在實(shí)際應(yīng)用中存在活菌的存活率、定殖、繁殖能力、穩(wěn)定性等問(wèn)題，因此篩選出穩(wěn)定性高、抑菌譜廣的高效生防菌株對(duì)植物病害的防治具有重要意義[22]。本研究篩選出的哈茨木霉菌株MA4對(duì)豇豆枯萎病菌的抑制率達(dá)到75.69%，抑菌譜測(cè)定發(fā)現(xiàn)其對(duì)番茄灰霉病菌、辣椒根腐病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、茄子褐紋病菌、番茄早疫病菌、茄子爛稈病菌和番茄果腐病菌均有較好的拮抗作用，抑制率在62.12%～86.93%;且穩(wěn)定性高，繼代培養(yǎng)10代后，其對(duì)豇豆枯萎病菌的抑菌率仍有80.86%。盆栽試驗(yàn)表明，接種14 d后防治效果達(dá)85.75%，且對(duì)豇豆植株具有一定促生作用。由此可見(jiàn)，哈茨木霉菌株MA4是具有生防潛力的菌株，下一步將對(duì)其發(fā)酵條件和生防機(jī)理等進(jìn)行研究，為研制綠色生物菌劑提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

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