人參中五氯硝基苯殘留的加工因子測定及其在膳食暴露評估中的應(yīng)用

王 瑩， 李耀磊， 于新蘭， 王 趙， 金紅宇?， 馬雙成?

（1.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100022；2.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所，新疆烏魯木齊 830049）

2015年版 《中國藥典》一部在藥材人參正文項下增加了16種有機(jī)氯的農(nóng)殘限度檢查[1］?；谇捌跀?shù)據(jù)監(jiān)測，按照2015版藥典規(guī)定人參中五氯硝基苯 （PCNB）不得過0.1 mg／kg的要求，人參中PCNB的超標(biāo)率較高。PCNB屬有機(jī)氯取代苯類殺菌劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對人畜低毒，對皮膚有一定的刺激性。在土壤中相當(dāng)穩(wěn)定，其半衰期約為4～10 個月， ADI 為 0.01 mg／kg b.w.[2］。 但其雜質(zhì)六氯苯是一種持久性有機(jī)污染物POPs，具有長期殘留性、生物蓄積性和高毒性，能夠?qū)е律矬w內(nèi)分泌紊亂、生殖及免疫機(jī)能失調(diào)以及癌癥等疾病[3］。PCNB在一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)已被列入環(huán)境激素污染物化學(xué)品目錄中，在某些食品作物上禁用或限制使用。由于致癌以及環(huán)境因素等原因，日本、新西蘭、瑞士、德國、韓國、印度及中國臺灣地區(qū)已全面禁止PCNB的使用。目前在我國取得PCNB登記的產(chǎn)品有25個，PCNB并未在人參藥材中登記。故從其危害性、高檢出率、不規(guī)范使用等方面，人參中PCNB攝入風(fēng)險評估具有重要意義。

農(nóng)藥殘留風(fēng)險評估是指通過測定農(nóng)藥的生物效應(yīng)、毒理學(xué)、污染水平和膳食暴露量等數(shù)據(jù)，定性或定量描述農(nóng)藥殘留對健康或生態(tài)的風(fēng)險。隨著農(nóng)藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象日益嚴(yán)重，開展食品藥品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險評估成為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)問題。值得關(guān)注的是，從人參藥材到入口服用通常會經(jīng)過加工處理（如水煎煮、乙醇提取、水浸泡等），這些加工方式會在不同程度上影響藥材中的農(nóng)藥殘留水平。在此過程中，若不考慮加工因素對農(nóng)藥殘留的影響而直接進(jìn)行膳食暴露評估，則會高估或低估農(nóng)藥殘留的暴露風(fēng)險。加工處理對農(nóng)藥殘留的影響程度通常采用加工因子 （PF）來描述。將加工因子納入暴露評估模型中，是國際上優(yōu)化評估方法、提高評估結(jié)果準(zhǔn)確性的通行做法[4-7］。德國聯(lián)邦風(fēng)險評估研究所 （BfR）在加工因子方面做了較多研究，其數(shù)據(jù)庫提供了多種農(nóng)藥在不同產(chǎn)品中的加工因子[8］，目前國外針對食品加工因子的研究也較多[9-10］。近些年來，中藥中逐步開展了有害殘留物風(fēng)險評估的研究工作[11-15］，但針對農(nóng)藥考慮加工因子的風(fēng)險評估工作尚處于空白狀態(tài)。

本研究測定了不同加工方式獲得的人參產(chǎn)品中PCNB的殘留量，得出PCNB不同加工過程中的加工因子，應(yīng)用于暴露評估，并為其他中藥材風(fēng)險評估提供有益借鑒。

1 材料

789 0 A氣相色譜儀配置電子捕獲檢測器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、超聲儀、離心機(jī) （美國Agilent公司）。丙酮、二氯甲烷、正己烷為色譜純 （美國Fisher公司）；濃硫酸 （優(yōu)級純，國藥集團(tuán)）。22種有機(jī)氯農(nóng)藥混標(biāo)對照品 （約10 μg／mL，中國食品藥品檢定研究院）。10批人參飲片來源于市場抽樣，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所康帥助理研究員鑒定為正品。

2 方法

2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

2.1.1 農(nóng)藥工作對照溶液制備 精密量取22種有機(jī)氯農(nóng)藥混標(biāo)1 mL至100 mL量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品工作溶液 （100 ng／mL）。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密量取適量工作對照溶液，用正己烷稀釋成 1、2、5、10、20、50 ng／mL的對照品溶液，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。

2.2 人參中PNCB殘留測定方法

2.2.1 人參中PNCB測定前處理方法 取人參粉末約5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加水30 mL，振搖10 min，精密加丙酮50 mL，稱定質(zhì)量；超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量；用丙酮補(bǔ)足減失的質(zhì)量，再加氯化鈉約8 g，精密加二氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min，再稱定質(zhì)量；用二氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，振搖使氯化鈉充分溶解，靜置，離心 （3 000轉(zhuǎn)／min）3 min，使完全分層，將有機(jī)相移入裝有適量無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，放置0.5 h。精密量取15 mL，于40℃水浴上減壓濃縮至約 1 mL，加正己烷約5 mL，減壓濃縮至近干，用正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻。小心加入硫酸 1 mL， 振搖 1 min， 離心 （3 000 轉(zhuǎn)／min）5 min，分取上清液，即得。

2.2.2 色譜條件 DB-1707毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）， Ni-ECD 電子捕獲檢測器；進(jìn)樣口溫度230℃；檢測器溫度300℃；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；色譜柱升溫程序為初始60℃，60℃／min升至170℃，5℃／min升至220℃，保持13 min，5℃／min升至240℃，25℃／min升至280℃，保持5 min。

2.3 人參不同加工方式處理方法

2.3.1 水浸泡 精密稱取人參粉末5 g，置200 mL燒杯中，加沸水 100 mL，加蓋，靜置1.0 h。取全部上清液至分液漏斗中，加入正己烷30 mL，振蕩萃取2 min，取上層正己烷層至梨形瓶中。重復(fù)萃取操作3次，回收所有上層正己烷至梨形瓶中，50℃下減壓濃縮至少許，移入25 mL量瓶中，用正己烷定容至刻度。取5 mL溶液至15 mL離心管中，再加入1 mL硫酸溶液，振蕩1 min， 離心 （3 000轉(zhuǎn)／min） 5 min， 取上清液，即得供試品溶液a。

2.3.2 水煎煮 精密稱取人參粉末5 g，置500 mL燒杯中，加水100 mL，加蓋置于電爐上加熱。待水沸騰后，保持微沸煎煮1 h。靜置取上清液至分液漏斗中，按 “2.3.1”項下方法配制，最終得供試品溶液b。

2.3.3 75%乙醇提取 精密稱取人參粉末5 g，置150 mL錐形瓶中，加75%乙醇100 mL，加熱回流2 h。待冷卻后，取上清液至分液漏斗中，按“2.3.1”項下方法配制，最終得供試品溶液c。

2.3.4 加工后剩余粉末PCNB測定 將上述“2.3.1”至 “2.3.3”項中處理后的人參粉末，置于烘箱中，50℃干燥6 h，得干燥粉末。精密稱取此粉末2 g，按 “2.2.1”項下方法操作。

2.4 暴露評估方法 農(nóng)藥殘留膳食暴露評估通常是指對農(nóng)產(chǎn)品或食品來源的農(nóng)藥殘留可能攝入量的定量評價，即根據(jù)農(nóng)藥殘留水平和人群膳食特點(diǎn)估計某農(nóng)藥的膳食暴露值。其中確定性評估也稱為點(diǎn)評估，是以點(diǎn)值的形式對人群的暴露參數(shù)作出的簡單描述。此種評估方法簡單易操作，應(yīng)用最為廣泛。在點(diǎn)評估過程中，除了了解膳食量和最大殘留量外，探索成品的加工因子，對于準(zhǔn)確的進(jìn)行暴露評估有重要意義。引入加工因子的點(diǎn)評估模型[5］如公式 （1）、（2） 所示。

式中EXPa代表某種化學(xué)物的短期暴露量；X97.5代表食物消費(fèi)量分布的97.5%分位數(shù)，本研究參考中國藥典規(guī)定人參最大日用量，即9 g；Cmax代表食物中某一化學(xué)物的最大殘留量，本實驗采用了10批人參藥材 PCNB的最大殘留量，即14.0 mg／kg；PF代表成品的加工因子；W代表人群的平均體質(zhì)量，以60 kg計。急性風(fēng)險商為短期暴露量值與安全參考劑量ARfD的比值，當(dāng)風(fēng)險商小于1時，表明暴露風(fēng)險可以接受。

3 結(jié)果

3.1 人參中PCNB測定方法的準(zhǔn)確度 與2015版《中國藥典》四部通則2531有機(jī)氯測定第一法相比，本研究對方法中的參數(shù)稍作改變，例如將正己烷代替石油醚作為最終定容溶液等，對本方法測定PCNB的靈敏度、準(zhǔn)確性及線性進(jìn)行考察。對6份空白樣品采用加標(biāo)回收方式，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 mg／kg。結(jié)果顯示PCNB回收率為103.3%，重現(xiàn)性2.13%，檢測限為0.002 5 mg／kg，PCNB的線性方程為Y＝7X-75.12，r＝0.999。表明在1.0～100 ng／mL范圍內(nèi)，線性良好。該方法的準(zhǔn)確度良好。

3.2 水及乙醇溶液中PCNB測定方法的準(zhǔn)確性 采用空白試劑中加標(biāo)回收方式，加標(biāo)質(zhì)量濃度為100 ng／mL，平行操作6份。結(jié)果表明，水及75%乙醇溶液中PCNB的提取回收率可達(dá)95%以上，RSD%小于4.0%。表明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.3 10批人參中PCNB測定結(jié)果 對市售的10批人參藥材采用 “2.2.1”項下方法處理，每個樣品平行處理2份，最終測得PCNB結(jié)果見表1。

表1 10批樣品PCNB測定結(jié)果Tab.1 Results of PCNB residues in ten batches of samples

3.4 不同加工方式PCNB轉(zhuǎn)移以及殘留率 采用水浸泡、水煎煮、75%乙醇提取3種方法對人參中PCNB在藥液中的轉(zhuǎn)移及藥材殘渣中的殘留情況進(jìn)行測定，見圖1。每種方法轉(zhuǎn)移率重復(fù)測定3次，取平均值。根據(jù)加工因子的計算公式[5］，即PF＝加工產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量／初級原料中的農(nóng)藥殘留量，見表2。

圖1 樣品中五氯硝基苯不同加工方式比較圖Fig.1 Comparison of PCNB residues with different extract methods in samples

表2 不同加工方式PCNB轉(zhuǎn)移率Tab.2 The transfer rates of PCNB residues with different extract methods

結(jié)果顯示水煎煮、水浸泡2種情況下，轉(zhuǎn)移至藥液中的PCNB農(nóng)藥量極低，不到5%，可能主要是由于PCNB作為有機(jī)氯農(nóng)藥，其水溶性極差，即使在煎煮、浸泡過程中亦少有轉(zhuǎn)移。采用水浸泡和煎煮方式后，藥材中殘留的PCNB量有所差別，煎煮后藥材中PCNB很低僅為6%，而浸泡后PCNB在藥材中的殘留量依舊很高為55.0%，有可能在水煎煮這種劇烈的條件下，PCNB發(fā)生了分解。75%乙醇提取方式幾乎將藥材中絕大部分PCNB轉(zhuǎn)移至藥液中。一般情況下若加工因子小于1，則表明加工過程農(nóng)藥殘留水平降低，反之則表示殘留水平升高。

4 討論

4.1 必要性 目前農(nóng)藥殘留監(jiān)測都是針對初級產(chǎn)品，未考慮加工過程對農(nóng)藥殘留的影響，故在使用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行膳食暴露評估時，往往會導(dǎo)致高估、低估，同樣不同加工方式也會影響產(chǎn)品中最大殘留限量MRL的制定。如FAO／WHO規(guī)定戊唑醇在葡萄中的MRLs值為2 mg／kg，葡萄酒生產(chǎn)過程能降低其殘留，顯然用葡萄中MRLs值進(jìn)行膳食暴露評估時會高估其對人體健康的影響，故Gonzalez-Rodriguez等[16］建議將葡萄酒中的戊唑醇MRLs值修訂為0.25 mg／kg。本研究中，如果不考慮加工過程，則風(fēng)險評估結(jié)果與實際攝入情況差異較明顯，尤其是在水煎煮食用方式下，加工因子為0.002。評估人參水煎煮藥液PCNB的每日攝入量時，是否引入加工因子這一因素，將導(dǎo)致結(jié)果相差500倍，即對風(fēng)險明顯的高估。因此，必須充分了解不同加工過程對農(nóng)藥殘留的影響，才能準(zhǔn)確的開展膳食暴露評估工作。

4.2 攝入風(fēng)險評估 人參藥材或飲片直接使用時，按照2015版中國藥典煎服最大推薦用量為9 g計，研粉吞服的推薦量為2 g。國家風(fēng)險評估中心張磊等[17］對全國各地區(qū)中草藥食用方式進(jìn)行調(diào)查，發(fā)出3 000多份調(diào)查問卷，得出結(jié)論中草藥最常見的服用方法是煎服，約有49.1%的人曾采用過煎服的方式；其次是用中草藥煮湯或者泡水的有39.4%。故對于藥材采用了水煎煮、水浸泡、研粉吞服3種方式的風(fēng)險分析。

進(jìn)一步了解含人參中成藥的工藝過程，查閱2015版 《中國藥典》總結(jié)出目前所收錄的中成藥品種中有70個品種含有人參藥材，而其中以原粉入藥的炮制方式所占比例最大，達(dá)到81.4%，剩余為水煎煮和乙醇提取，見表3。

表3 中國藥典中含人參中成藥各制法所占比例Tab.3 Proportion of Chinese patent medicines containing P．ginseng in Ch.P

70種中成藥中人參處方比例為0.2%～20%，按照藥典用法用量對以上70種進(jìn)行統(tǒng)計，原粉入藥的成藥人參日最大攝入量約2.5 g（參芩白術(shù)丸）；75%乙醇提取入藥的日最大攝入量為2 g（津力達(dá)顆粒）；水煎煮入藥的人參日最大攝入量約3 g。分別對3種方式的最大攝入值代入公式 （2）進(jìn)行風(fēng)險分析。由于缺少PNCB的ARfD值，本研究安全參考劑量采用了ADI值。將表2中得出的加工因子代入公式 （1）、（2），對中藥材及含人參中成藥不同加工方式PCNB的暴露量及急性風(fēng)險商進(jìn)行計算，見表4。

表4顯示，按照風(fēng)險商值進(jìn)行判斷，人參藥材煎煮、泡水及通過煎煮制成中成藥的方式，產(chǎn)生的風(fēng)險商均很低，不到1.0%，可認(rèn)為通過此類方式攝入人參產(chǎn)生風(fēng)險極小。直接采用藥材研粉吞服，以及原粉入藥和75%乙醇提取制成中成藥的方式，產(chǎn)生的風(fēng)險商分別為4.67%、5.83%、4.57%，風(fēng)險值亦較低。但考慮到聯(lián)合風(fēng)險評估，由于中藥材攝入在人體總的膳食結(jié)構(gòu)中所占比例很低，故此3種方式的風(fēng)險仍需關(guān)注。比如按照2015版 《中國藥典》四部9302通則，農(nóng)藥殘留量最大限量制定時安全因子設(shè)為100，即認(rèn)為每日由中藥材及其制品中攝取的農(nóng)藥殘留量應(yīng)不大于日總暴露量的 1%[18］。

4.3 局限性 本研究中加工因子的測定為實驗條件下進(jìn)行，樣品量均較小，且加工的重要參數(shù)亦與實際生產(chǎn)有所差異。而這些參數(shù)都會對結(jié)果產(chǎn)生一定影響，比如水煎煮、乙醇提取時間、提取溶劑體積、提取溫度等。故要獲得某一具體品種的PCNB加工因子，還應(yīng)盡可能使實驗室模擬的加工過程接近商業(yè)化加工過程，或者在工廠生產(chǎn)條件下，從中藥材到成品分階段對其中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行監(jiān)控，從而得到更具有實際應(yīng)用價值的結(jié)果。

本研究建立了人參粉末、人參藥液、75%乙醇提取液中 PCNB的測定方法。對10批人參中PCNB殘留量進(jìn)行測定，不合格率較高達(dá)到50%。對不同加工方式中PCNB的轉(zhuǎn)移進(jìn)行測定，得出轉(zhuǎn)移率及加工因子，通過點(diǎn)評估模式計算風(fēng)險商。雖然人參中PCNB不合格率較高，但通過攝入人參中PCNB對人體產(chǎn)生風(fēng)險的可能性很低。其中采用水煎煮、水浸泡方式，藥液中PCNB量極低。人參藥材研粉吞服、原粉入藥、75%乙醇提取后中成藥的風(fēng)險相對較高，應(yīng)引起關(guān)注，必要時應(yīng)增加含人參此類工藝中成藥的PCNB限度檢查。