中華沙塘鱧(Odontobutis sinensis)精子入卵過程掃描電鏡(SEM)觀察

劉 鴻，王 春

(1.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，新疆 烏魯木齊 830000；2.上海海洋大學(xué)，上海 201306)

中華沙塘鱧(Odontobutissinensis)隸屬鰕虎魚亞目(Gobioidei)、塘鱧科(Eleotridae)，沙塘鱧屬(Odontobutis)，又名沙烏鱧。體粗壯，頭大而闊，稍扁平，腹部渾圓，后部側(cè)扁。鰭兩個，各鰭無硬棘。胸鰭大，圓形，尾鰭后緣稍圓，無側(cè)線。體呈黑褐色，腹部淡黃，體側(cè)有不規(guī)則的大塊黑色斑紋，各鰭均具有淡黃色與黑色相間的條紋，其魚卵具黏著絲，屬黏性卵[1-2]。沙塘鱧屬魚類為東亞特有的淡水小型肉食性魚類，因其肉質(zhì)緊實無細(xì)刺，近幾年來成為長江中下游一帶的暢銷經(jīng)濟魚類，已成為中華絨螯蟹池塘養(yǎng)殖主要的混養(yǎng)對象。近年來有關(guān)中華沙塘鱧的研究相對較多，主要以分子生物學(xué)[3]、年齡生長[4]、種群分布[5]、人工繁育[6]及生物多樣性[7]等研究為主。

隨著掃描電子顯微鏡技術(shù)、生物樣品制備以及脫水干燥等技術(shù)的成熟，掃描電子顯微鏡在生物學(xué)方面得到了較為廣闊的應(yīng)用。當(dāng)前國內(nèi)外對鰕虎魚亞目魚類行為學(xué)研究以及精子入卵掃描電鏡觀察都有較多報道[8-13]，但有關(guān)黏性卵精子入卵機制研究相對較少。Giulianini等[14]研究證明鰕虎魚精子可完全穿過成熟魚卵的黏著絲，解釋了成熟卵細(xì)胞對于精子的選擇機制。2009年何振邦[11]等對中華烏塘鱧精子入卵的整個過程加以捕捉并描述，討論了單精入卵機制，對卵膜孔區(qū)的嵴狀突起加以討論。2014年曹晉飛[4]對中華沙塘鱧胚胎發(fā)育予以研究，獲得不同發(fā)育階段所需時間及有效積溫。文章旨在通過對中華沙塘鱧受精過程的觀察，探究該魚的繁殖行為，以期提高人工繁育孵化率。

1 材料和方法

本實驗所采樣品均為野生中華沙塘鱧，捕獲之后在暫養(yǎng)池暫養(yǎng)。本次試驗采樣總計兩次，選擇已達(dá)性成熟的雌雄個體共約300尾，雌雄比例2∶1，雌魚平均體重為35.7 g，雄魚平均體重32.4 g。中華沙塘鱧每年4月下旬性腺開始發(fā)育，繁殖期為5月上旬，水溫15～20℃。在性腺發(fā)育成熟之后，提前16 h按個體體重注射絨毛膜促性腺激素(HCG)和促黃體素激素(LRH—A2)，注射濃度按體重計量[15-17]。

催產(chǎn)后采用人工濕法授精。輕壓魚腹獲取成熟生殖細(xì)胞，用生理鹽水將精子稀釋后以羽毛攪拌將其與成熟卵細(xì)胞均勻混合。授精后分別從5 s開始直至1 min，間隔5 s取受精卵固定，1 min后間隔30 s，所固定最長受精時間為5 min，每次固定卵子80～120粒。

樣品用磷酸戊二醛溶液固定，其中戊二醛濃度為2.5%。樣品固定之后采用逐級酒精脫水，乙醇濃度梯度分別為30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%，各級酒精脫水時間為10 min，之后保存于乙酸甲酯中，用以置換出乙醇[18]。

將處理之后的樣品置于二氧化碳臨界干燥裝置中干燥，取出后用解剖針、解剖刀、鑷子以及手術(shù)剪在體視顯微鏡下去除黏著絲，并固定在掃描電鏡樣品臺的導(dǎo)電膠上，噴金之后觀察。

2 結(jié)果

2.1 精子的外部形態(tài)

中華沙塘鱧的精子由頭部、頸部、體部和尾部4部分組成，全長20～25 μm。頭部橢圓形，2.25±0.25 μm，短軸1.00±0.20 μm。頸部較短，頸部之后為體部，長度約為1.5 μm左右。體部之后為精子的尾部，可分為前、中、后三部分，尾部的總長為19.0±1.0 μm(圖1)。

圖1 中華沙塘鱧精子(a:放大倍數(shù)3000;b:放大倍數(shù)5000)

2.2 成熟卵子的外部形態(tài)

中華沙塘鱧的成熟卵呈鮮艷黃色，為圓球形，卵子直徑為1.30±0.02 mm。黏著器位于卵子動物極一端，由基底、篩網(wǎng)和黏著絲三部分組成。揭開成熟卵子的卵膜，觀察卵核內(nèi)部結(jié)構(gòu)，掃描電鏡下卵核的表面為突起的小顆粒，不平坦。卵膜厚度11.8±0.8 μm。中華沙塘鱧成熟魚卵黏著絲長度可達(dá)575.0±25.0 μm，篩狀圓柱高度為50.0±3.0 μm。粘著器底層篩孔數(shù)量為每周80左右，上層數(shù)目較多。底層篩孔最大，從下往上篩孔直徑逐漸減小，有5～6層。底層篩孔外徑約7.5±2.5 μm，高度10 μm左右，上層篩孔大小不一，篩孔長度可達(dá)20 μm以上，寬度5.5±0.5 μm。中華沙塘鱧成熟卵膜表面有嵴狀突起，將成熟中華沙塘鱧黏著絲剔除可觀察到卵膜孔區(qū)，黏著絲內(nèi)部卵膜平滑，無隆起的嵴，其正中為受精孔，卵膜孔區(qū)直徑為172.5±2.5 μm，受精孔為橢圓形，長徑為7.2±0.2 μm，短徑4.5±0.2 μm(圖2)。

2.3 精子入卵過程

對固定的中華沙塘鱧受精卵觀察可知，中華沙塘鱧精子入卵過程為：精子通過成熟卵細(xì)胞近動物極篩柵底層篩孔，進(jìn)而到達(dá)受精孔，單個精子入卵后受精孔關(guān)閉，外部精子隨即降解，卵細(xì)胞進(jìn)入胚胎期(圖3)。

2.3.1 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精5 s 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精5 s，精子主要集中于卵細(xì)胞黏著絲下卵膜表面，500倍鏡下可觀察到篩網(wǎng)孔前聚集的大量精子，在掃描電鏡(SEM)下能夠清楚地看到其外部形態(tài)。

2.3.2 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精15 s 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精15 s，大量精子開始進(jìn)入篩網(wǎng)孔，準(zhǔn)備穿過篩網(wǎng)，4 000倍鏡下，可觀察到篩孔外部大量的精子尾部，表明已有精子進(jìn)入篩網(wǎng)孔，且精子在進(jìn)入篩網(wǎng)孔時已經(jīng)開始相互競爭。

2.3.3 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精20 s 中華沙塘鱧授精20 s，大量精子已進(jìn)入黏著器底部篩網(wǎng)孔，篩網(wǎng)外部僅剩余少量精子，且成熟卵細(xì)表面開始出現(xiàn)絮狀物。

2.3.4 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精25 s 去除中華沙塘鱧受精卵黏著器底部黏著絲觀察發(fā)現(xiàn)，中華沙塘鱧授精25 s，精子正處于穿過篩網(wǎng)孔階段，在篩網(wǎng)孔橫截面上可以看到大量的精子，并有少量絮狀物產(chǎn)生。

2.3.5 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精55 s 授精55 s，大量精子完全穿過篩網(wǎng)孔，進(jìn)入卵膜孔區(qū)，但部分精子進(jìn)入卵膜孔區(qū)后會反向游動，甚至游離卵膜孔區(qū)。

2.3.6 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精60 s 在中華沙塘鱧成熟卵授精60 s，受精孔內(nèi)已有精子進(jìn)入，同時受精孔外的精子已經(jīng)開始解體，解體從精子的尾部開始，直至頭部后完全解體。

2.3.7 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精120 s 中華沙塘鱧成熟卵細(xì)胞授精120 s，精子進(jìn)入受精孔，隨后受精孔關(guān)閉，卵膜孔區(qū)不再平整，受精卵表面精子加速解體。之后成熟卵完成受精過程，吸水后進(jìn)入胚胎發(fā)育階段。

圖2 中華沙塘鱧成熟卵子結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 中華沙塘鱧生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能

中華沙塘鱧卵為黏性卵，當(dāng)卵子成熟后雌性將魚卵產(chǎn)于水中，成熟卵細(xì)胞遇水立即產(chǎn)生黏性，卵細(xì)胞下端黏著絲具有極強的黏附能力，能穩(wěn)固的將卵細(xì)胞黏連于基質(zhì)之上，成熟雌性排卵后在整個受精以及發(fā)育過程中都能牢固附著于底質(zhì)，有助于提高受精率和孵化率。分析認(rèn)為，黏著絲附著于雄性精子軌跡有助于保持卵膜孔區(qū)清潔，提高受精率[11]。就生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)而言，中華沙塘鱧成熟精子與中華烏塘鱧精子區(qū)別較大。中華烏塘鱧(Bostrichthyssinensis)成熟精子頭部為圓形[11]，而中華沙塘鱧精子頭部為橢圓形，且中華沙塘鱧精子較中華烏塘鱧精子頭部以及尾部大。但中華沙塘鱧與中華烏塘鱧成熟卵細(xì)胞的大小相近、結(jié)構(gòu)相似，黏著絲、卵膜厚度以及篩孔大小及長度相差不大。主要的區(qū)別在于卵膜孔區(qū)結(jié)構(gòu)，中華沙塘鱧卵膜孔區(qū)較為平整，無隆起的嵴存在，而中華烏塘鱧卵膜孔區(qū)有12～16條由基地隆起而形成的嵴狀結(jié)構(gòu)，以受精孔為中心呈輻射狀分布，稱為輻射嵴，且個輻射嵴組成若干個扇形區(qū)(圖4)[11]。

3.2 中華沙塘鱧繁殖行為學(xué)與生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)關(guān)系

與草鰕虎魚(Zosterisessorophiocephalus)繁殖行為學(xué)相似，中華沙塘鱧繁殖前由雄魚率先產(chǎn)出精子軌跡，繼而雌魚釋放成熟卵細(xì)胞并附著于產(chǎn)卵基質(zhì)，精子激活后開始游動并使卵細(xì)胞受精[19]。2000年Giulianini等通過使用掃描電鏡對鰕虎魚精子入卵的過程予以觀察，證實了精子完全可以通過黏著絲成功到達(dá)受精孔[20]，與本文研究結(jié)果相符。黏著絲對成熟卵細(xì)胞準(zhǔn)確受精不僅不會差生阻礙，而且能夠保證整齊黏附于同一基質(zhì)的大量魚卵同時受精，進(jìn)而有效降低精子進(jìn)入卵細(xì)胞的能量消耗。

圖3 中華沙塘鱧精子入卵過程

圖4 中華烏塘鱧生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)