阿爾茨海默病的tau蛋白病理傳播機(jī)制與調(diào)節(jié)*

李思蘋, 李文惠，孫安陽△

(1上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院, 2上海健康醫(yī)學(xué)院腦退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201318)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為典型表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其標(biāo)志性病理特征之一是神經(jīng)纖維纏結(jié)形成。八十年代的研究揭示，神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分是微管相關(guān)蛋白tau。AD患者腦中tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致其與微管結(jié)合能力降低，磷酸化的tau蛋白聚集形成細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)，干擾神經(jīng)元的正常功能，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的變性與死亡。早期研究主要關(guān)注神經(jīng)纖維纏結(jié)在體外和單個細(xì)胞水平形成的機(jī)制、不同腦區(qū)的發(fā)展變化次序與功能意義，并未涉及不同細(xì)胞之間的病理聯(lián)系。近年來研究發(fā)現(xiàn)，tau蛋白異常而形成的病理分子并非只有神經(jīng)纖維纏結(jié)一種，還有其它不同的分子形式(如tau寡聚體)與病理狀態(tài)，這些tau蛋白異常統(tǒng)稱為tau病理(tau pathology)。后期還發(fā)現(xiàn)，tau蛋白具有和朊病毒(prion)類似的特性，可以在大腦不同功能區(qū)之間進(jìn)行傳播[1]。目前認(rèn)為，病腦內(nèi)先是一小部分細(xì)胞產(chǎn)生了tau蛋白聚集物，然后通過某些機(jī)制再傳播到鄰近或較遠(yuǎn)的正常細(xì)胞，最終導(dǎo)致大量的tau病理形成和神經(jīng)元變性，造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。隨著近幾年對tau病理傳播研究的逐步深入，將為AD的發(fā)病機(jī)制以及干預(yù)策略提供新的思路。

1 Tau蛋白的亞型與基本功能

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，正常狀態(tài)下主要定位于神經(jīng)元軸突，主要功能是促進(jìn)微管的形成和維持微管的穩(wěn)定。生理狀態(tài)下，位于樹突的tau蛋白水平極低；人腦的tau蛋白在額葉、顳葉、海馬和內(nèi)嗅皮層等腦區(qū)水平較高，并具有高度可溶性和熱穩(wěn)定性。Tau蛋白長度因mRNA加工時外顯子2、3和10的可變剪接(或稱選擇性剪接)而異，依據(jù)N端插入序列(0N/1N/2N)的數(shù)目以及微管結(jié)合重復(fù)區(qū)(3R/4R)的數(shù)目不同，將tau蛋白分為6種亞型[2]。以最長的2N4R tau為例，雖然理論上可有84個磷酸化位點(diǎn)，但正常成熟腦內(nèi)平均僅有數(shù)個生理性磷酸化位點(diǎn)，負(fù)性調(diào)節(jié)tau蛋白與微管的結(jié)合。然而，在特定病理狀態(tài)下，tau蛋白高度異常的磷酸化位點(diǎn)很多，已報(bào)道的病理性磷酸化位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到40個左右。大量實(shí)驗(yàn)資料顯示，不同亞型tau蛋白的生理和病理表現(xiàn)存在顯著差異。

2 Tau病理傳播的現(xiàn)象與特征

早在1991年，Braak等[3]對AD患者大腦病理解剖時觀察到，神經(jīng)纖維纏結(jié)一般先出現(xiàn)在內(nèi)嗅皮層及其周邊區(qū)域，隨后可以在海馬和杏仁核等位置觀察到，最后會廣泛地分布在大腦中。直到2009年，F(xiàn)rost等[4]首次提出病變tau蛋白會以某種機(jī)制在大腦各區(qū)域之間進(jìn)行傳播，并觀察到外部tau蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后會引起內(nèi)部原有tau蛋白的聚集，這一發(fā)現(xiàn)引起了研究人員對tau病理傳播的關(guān)注。在隨后幾年中，各種體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，磷酸化tau蛋白可以在細(xì)胞間進(jìn)行傳播，并可以通過突觸在神經(jīng)元間進(jìn)行傳遞[5-7]；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Liu等[8]通過對比不同月齡小鼠腦部磷酸化tau蛋白的分布，觀察到tau蛋白可以傳播到有神經(jīng)投射的2個腦區(qū)。Ahmed等[9]向2月齡P301S-tau轉(zhuǎn)基因小鼠左側(cè)海馬及上方大腦皮層/白質(zhì)注射含tau聚集體的轉(zhuǎn)基因小鼠腦提取物，2周后觀察到神經(jīng)纖維纏結(jié)病理開始形成，隨著時間的推移，tau病理蛋白數(shù)量不斷增加，并傳播到了對側(cè)半腦與注射點(diǎn)有突觸連接的亞區(qū)，而非注射點(diǎn)鄰近的腦區(qū)。Tau蛋白病理傳播這一現(xiàn)象也在人腦中觀察到,DeVos等[10]通過對不同分期的AD患者腦組織的研究分析發(fā)現(xiàn)，tau病理蛋白早期也沿著有突觸連接的神經(jīng)元傳播，病理分布與Braak分期的腦區(qū)發(fā)展路徑一致。雖然所有tau蛋白亞型都可以在神經(jīng)元之間傳播，但不同tau蛋白分子在傳播速率和特性上有一定差別，例如，4R tau產(chǎn)生的tau病理可以傳播到較遠(yuǎn)的腦區(qū)，而3R tau和突變tau產(chǎn)生的tau病理大多停留于病理初始形成部位，而不會傳播到其它較遠(yuǎn)的腦區(qū)[11]。

3 Tau病理蛋白作為“種子”傳播的形態(tài)

Tau蛋白高度可溶，對于加熱和酸處理十分穩(wěn)定。溶液中的tau蛋白并不折疊成已知的二級結(jié)構(gòu)，而呈“無規(guī)卷曲”的結(jié)構(gòu)；但在與微管結(jié)合的過程中，tau蛋白將折疊成穩(wěn)定的構(gòu)象[12]。病理性tau蛋白在聚集與纖維化過程中，一部分微管結(jié)合重復(fù)區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)閯傂缘摩抡郫B結(jié)構(gòu)，構(gòu)成神經(jīng)纖維纏結(jié)的核心，而其余區(qū)域仍保留未折疊狀態(tài)，構(gòu)成tau纖維的絨毛狀外衣[2]。Tau蛋白易于產(chǎn)生錯誤折疊(misfolding)。與朊病毒部分相似，錯誤折疊的tau蛋白可以充當(dāng)“種子”使正常tau蛋白也錯誤折疊。此外，肝素可以促進(jìn)惰性的tau單體向“種子”轉(zhuǎn)變，進(jìn)而聚集更多的tau分子[13]。

細(xì)胞生物學(xué)研究顯示，tau的三聚體是最小的可傳播“種子”，tau聚合物與細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPGs)結(jié)合后被細(xì)胞攝入，再作為“種子”引起細(xì)胞內(nèi)tau聚集[14]。將不同生化特性的病理性tau蛋白作為“種子”注射至P301S-tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)可產(chǎn)生各不相同的神經(jīng)病理表型[15]，因而認(rèn)為，tau蛋白的結(jié)構(gòu)差異決定各自的“種子”活性。

4 Tau病理傳播途徑

在神經(jīng)元沒有發(fā)生細(xì)胞死亡和膜滲漏的情況下，病理性tau蛋白也可從細(xì)胞中釋放出來，被受體細(xì)胞內(nèi)吞，其中錯誤折疊的tau分子作為“種子”使正常tau蛋白也發(fā)生錯誤折疊，導(dǎo)致tau病理在細(xì)胞間傳播。細(xì)胞間釋放與攝取病理性tau蛋白涉及依賴于ATP的囊泡機(jī)制與直接的非囊泡機(jī)制，見圖1。

4.1病理性tau蛋白的囊泡釋放 有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞過度表達(dá)tau蛋白時，可通過囊泡方式將其釋放出來[16]。Saman等[17]對人類神經(jīng)瘤母細(xì)胞M1C進(jìn)行培養(yǎng)，通過減少培養(yǎng)皿中四環(huán)素以誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)tau蛋白，在免疫電鏡及生化實(shí)驗(yàn)中觀察到磷酸化tau蛋白位于細(xì)胞內(nèi)的多泡體(multivesicular body)中，以外泌體(exosomes)形式釋放至細(xì)胞外。Wang等[18]培養(yǎng)小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2A及大鼠皮層神經(jīng)元，通過微流體設(shè)備檢測到神經(jīng)元通過外泌體釋放tau蛋白。此外，Dujardin等[19]對大鼠皮層神經(jīng)元及N1-E115細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察到tau蛋白也可以通過細(xì)胞膜出芽包裹在微泡(ectosomes)內(nèi)，而后釋放到細(xì)胞外。AD早期患者腦脊液中磷酸化tau蛋白含量較高也有很大可能與此相關(guān)。

4.2病理性tau蛋白的胞吐釋放 Michel等[20]在實(shí)驗(yàn)中觀察到，tau寡聚體可以被溶酶體攝取，推測tau蛋白可以通過胞吐作用(exocytosis)被細(xì)胞釋放。Fontaine等[21]觀察到，上調(diào)DnaJ50/Hsc70蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)tau蛋白的釋放，而通過小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制胞吐釋放關(guān)鍵蛋白SNAP-23的表達(dá)，會使DnaJ50過度表達(dá)的細(xì)胞中tau蛋白釋放量減少，表明tau蛋白可以通過SNAP-23介導(dǎo)的胞吐方式被細(xì)胞釋放。胞吐釋放的tau蛋白在細(xì)胞外無囊泡包裹。

Figure 1.Potential mechanisms for neuron-to-neuron transmission of tau aggregates. Tau aggregates are released via a mechanism of ectosomes (A), exosomes (B), exocytosis (C) and direct secretion (D). The uptake of tau aggregates takes place by recipient neuron through endocytosis /macropinocytosis (E), and receptor-mediated endocytosis (F). Neuron-to-neuron transmission of pathological tau aggregates is also mediated through tunneling nanotubes (G).

圖1Tau聚集體在神經(jīng)元之間傳播的主要機(jī)制

4.3病理性tau蛋白的直接分泌 Merezhko等[22]通過小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞N2A和大鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察到，過表達(dá)的tau蛋白以磷酸化寡聚物的形式聚集在質(zhì)膜微區(qū)內(nèi)，并以無囊泡形式分泌；這一非常規(guī)的過程不需要ATP，但對膜特性的改變(如膽固醇和鞘磷脂含量變化)非常敏感。細(xì)胞表面硫酸肝素糖蛋白可能通過促進(jìn)病理性tau蛋白穿膜后釋放而易化tau蛋白的分泌。這種不依賴ATP的直接釋放方式可能使病理性tau蛋白從神經(jīng)元逃逸變得更加便捷。

4.4病理性tau蛋白的攝取 生理性和病理性tau蛋白可以通過非受體介導(dǎo)和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞(endocytosis)進(jìn)入細(xì)胞。內(nèi)吞的種類與機(jī)制比較復(fù)雜，大致包括網(wǎng)格蛋白依賴性與網(wǎng)格蛋白非依賴性2種，傳統(tǒng)的內(nèi)吞不依賴于肌動蛋白(actin)。Michel等[20]使用活細(xì)胞聚集傳感器檢測到，熒光標(biāo)記的外源性tau蛋白單體可被SH-SY5Y細(xì)胞以內(nèi)吞的方式快速攝取，在pH較低的內(nèi)小體房室聚集形成病理性種子，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)源性tau蛋白參與聚集；利用超分辨率成像技術(shù)還證實(shí)，這種內(nèi)源性和外源性tau蛋白組成的纖維性種子可以再從細(xì)胞中釋放出來，實(shí)現(xiàn)tau蛋白病理傳播的進(jìn)出環(huán)節(jié)。

巨胞飲(macropinocytosis)是內(nèi)吞的另一種形式，由肌動蛋白驅(qū)動細(xì)胞膜皺褶形成，產(chǎn)生大的細(xì)胞內(nèi)液泡，直徑一般為0.5 μm～5 μm。巨胞飲參與清除凋亡細(xì)胞、免疫反應(yīng)和更新細(xì)胞膜等細(xì)胞功能。Holmes等[23]通過免疫熒光標(biāo)記tau蛋白聚集體，發(fā)現(xiàn)C17.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞是通過巨胞飲機(jī)制攝取tau蛋白聚集體。然而，Evans等[24]在人類神經(jīng)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中觀察到與前期報(bào)道不同的結(jié)果。細(xì)胞外tau蛋白單體和聚集體均可被人類神經(jīng)元快速高效地?cái)z取，tau蛋白單體通過快速的動力蛋白依賴性內(nèi)吞和緩慢的肌動蛋白依賴性巨胞飲進(jìn)入神經(jīng)元；tau蛋白聚集體進(jìn)入人類神經(jīng)元不依賴于肌動蛋白，這一特點(diǎn)符合傳統(tǒng)的內(nèi)吞，而不符合巨胞飲機(jī)制。也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，tau蛋白可以與受體(如HSPGs和APP)結(jié)合，而被接受細(xì)胞所攝取[25]。因而，細(xì)胞攝取tau蛋白的機(jī)制既取決于tau蛋白的分子種類，也存在種屬和細(xì)胞類型差異。

4.5經(jīng)隧道納米管(tunneling nanotubes，TNTs)傳播 隧道納米管是一種細(xì)胞間通道，這種細(xì)胞間動態(tài)的結(jié)構(gòu)可以持續(xù)幾分鐘到幾個小時不等，直徑一般在20 nm～500 nm之間[26]，對于細(xì)胞之間的物質(zhì)傳輸尤其是距離較遠(yuǎn)的細(xì)胞具有重要作用。研究人員通過熒光顯色對tau蛋白在體外培養(yǎng)細(xì)胞間的分布進(jìn)行觀察，在細(xì)胞間的隧道納米管中發(fā)現(xiàn)了tau寡聚體的存在，說明tau寡聚體可以通過隧道納米管在細(xì)胞間進(jìn)行傳播[27]。另外，tau蛋白也會影響隧道納米管的形成和功能，細(xì)胞外加入tau蛋白聚集體將促進(jìn)神經(jīng)元之間隧道納米管的形成[28]，兩者之間起到相互促進(jìn)的作用。

5 Tau病理傳播的調(diào)控因素

Tau蛋白傳播受到很多因素的影響，通過研究影響tau病理傳播的調(diào)控因素，可以找到抑制tau病理傳播的方法，減輕tau病理對AD的影響。

5.1β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)對tau蛋白病理傳播的影響 研究人員選用APPsw/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠與內(nèi)嗅皮層表達(dá)病變tau蛋白的rTgTauEC小鼠雜交后代作為實(shí)驗(yàn)組小鼠，并在小鼠10個月齡和16個月齡時觀察tau病理傳播，發(fā)現(xiàn)與僅在內(nèi)嗅皮層表達(dá)tau蛋白的對照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在海馬DG區(qū)和CA1區(qū)tau蛋白的表達(dá)更多，證明了大腦皮層中的Aβ加速了tau蛋白的傳播[29]。向5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬和大腦皮層注射來源于AD患者的配對螺旋樣纖維(paired helical filament, PHF)-tau，Aβ病理通過促進(jìn)AD tau的種子活性，加速神經(jīng)氈類斑塊內(nèi)tau的聚集，從而促進(jìn)tau病理傳播[30]；另一組研究通過體外和在體實(shí)驗(yàn)也觀察到，聚集前的Aβ“種子”可以交叉激活“沉默的”tau“種子”，加速tau蛋白聚集與tau病理形成[31]。另有離體研究顯示，正常培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞主要釋放C末端被酶切的tau片段(不含微管結(jié)合區(qū))，不具有tau傳播活性，僅在加入Aβ引起神經(jīng)細(xì)胞損傷后，才釋放含有微管結(jié)合區(qū)的可聚集tau[32]。

5.2Tau病理傳播隨神經(jīng)元運(yùn)動活動增強(qiáng) Tau蛋白和Aβ作為AD的2大關(guān)鍵特征，具有一定的相似性。在之前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Aβ數(shù)量會隨著神經(jīng)元活性增強(qiáng)而增加[33]，故提出tau病理傳播是否也會隨神經(jīng)元活性增強(qiáng)而增加這一問題。Wu等[34]在體外實(shí)驗(yàn)中，用GABAA受體拮抗劑印防己毒素持續(xù)刺激神經(jīng)元以增加其興奮性，同時觀察到神經(jīng)元的tau蛋白釋放量明顯增加。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過光遺傳學(xué)或化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)刺激rTg4510轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬神經(jīng)元，也觀察到了類似的結(jié)果，說明tau病理傳播會隨神經(jīng)元活動增強(qiáng)而增加。

5.3小膠質(zhì)細(xì)胞通過外泌體途徑促進(jìn)tau傳播 Asai等[35]通過向小鼠內(nèi)嗅皮層注射AAV-GFP/tau構(gòu)建tau傳播至齒狀回的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停硗庥肞301S-tau轉(zhuǎn)基因小鼠作為平行驗(yàn)證。通過側(cè)腦室注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體或喂飼PLX3397(CSF-1R抑制劑)清除小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞后，內(nèi)嗅皮層向齒狀回tau蛋白的傳播受到明顯抑制。此外，小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)tau傳播作用可能是通過外泌體途徑發(fā)揮作用的，因?yàn)榻?jīng)RNA干擾或藥物GW4869抑制鞘磷脂酶2 (sphingomyelinase-2)活性以抑制外泌體合成后，也可顯著抑制tau病理傳播。

5.4上調(diào)星型膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體活性抑制tau傳播 不同神經(jīng)元可經(jīng)過突觸傳播tau病理，而星形膠質(zhì)細(xì)胞則位于神經(jīng)突觸的周圍。培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)外源性轉(zhuǎn)錄因子EB將促進(jìn)tau纖維的攝取和溶酶體活性；在體誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子EB則降低P301S-tau轉(zhuǎn)基因小鼠(PS19小鼠)海馬的病理，并顯著減弱了tau蛋白從同側(cè)向?qū)?cè)海馬的擴(kuò)散[36]。另外，培養(yǎng)的原代神經(jīng)元通過亮抑蛋白酶肽(leupeptin)抑制溶酶體功能，使神經(jīng)元分泌的磷酸化tau蛋白量和tau蛋白總量也明顯增加[37]。

6 總結(jié)及展望

Tau蛋白異常形成tau病理是阿爾茨海默病的關(guān)鍵特征之一。病理性tau蛋白具有朊病毒樣特性，可以在不同神經(jīng)元和腦區(qū)之間傳播。已有多個研究揭示，tau病理的遠(yuǎn)程傳播主要發(fā)生在有突觸連接的2個腦區(qū)之間。生理狀態(tài)下腦內(nèi)tau蛋白主要位于神經(jīng)元軸突，也以pM級濃度存在于細(xì)胞間液中；在特定病理狀態(tài)下細(xì)胞間液的濃度可升高10倍以上。雖然正常tau單體分子能否進(jìn)入神經(jīng)元目前資料尚不一致，但病理性tau聚集物能夠高效地進(jìn)入神經(jīng)元或非神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)被大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。含tau病理的神經(jīng)元通過外泌體、胞吐或直接釋放等機(jī)制將tau病理“種子”釋放到胞外，被另一個神經(jīng)元通過內(nèi)吞或巨胞飲等方式攝入，從而實(shí)現(xiàn)tau病理傳播的出進(jìn)環(huán)節(jié)。進(jìn)入神經(jīng)元的tau病理“種子”繼續(xù)聚集內(nèi)源性tau單體及其他分子，最終形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。已有人建立超靈敏的方法檢測tau病理的“種子”活性(seeding activity)，以反映tau病理傳播的體內(nèi)狀況，希望可用作AD輔助診斷和追蹤療效的手段之一。Tau病理傳播的程度也會受到胞外Aβ水平、神經(jīng)元興奮性以及小膠質(zhì)細(xì)胞等因素的調(diào)節(jié)。通過深入研究疾病狀態(tài)下tau病理傳播途徑及關(guān)鍵調(diào)控因素，人們希望找到阻遏tau病理傳播的關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而研發(fā)出治療阿爾茨海默病的有效藥物。

目前，對于tau病理傳播的分子細(xì)節(jié)和臨床意義尚有許多不明確之處，例如，疾病狀態(tài)下腦內(nèi)tau病理傳播與離體實(shí)驗(yàn)的情況是否類似？Tau病理傳播對相關(guān)疾病如AD和額顳葉癡呆的認(rèn)知障礙的貢獻(xiàn)度有多大？有哪些可成為有潛力阻遏tau病理傳播的潛在靶點(diǎn)？葉酸、維生素B12以及黃酮類中藥提取物抑制AD動物模型的tau病理發(fā)展[38]，這些內(nèi)源性活性分子是否會影響tau病理的傳播也值得進(jìn)一步研究。最新研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可以通過醫(yī)源性方式進(jìn)行人際傳播[39]，tau蛋白是否也有類似的人際傳染性？這也是tau病理研究的方向之一。