沉默IFN-γR表達(dá)對(duì)大鼠BMMSCs免疫調(diào)節(jié)能力的影響*

蘭紹陽(yáng)，譚梅傲，陶雙友，蔡佳仲，康錦花，陳 斌△

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院脾胃病科， 2第一臨床醫(yī)學(xué)院， 3脾胃研究所， 廣東 廣州 510405)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是存在于骨髓中的多潛能干細(xì)胞，能分化為軟骨細(xì)胞和肝細(xì)胞等多種細(xì)胞。因?yàn)锽MMSCs免疫原性弱，是異體干細(xì)胞移植治療的理想細(xì)胞[1-3]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs具有免疫調(diào)節(jié)能力，能用于治療免疫性肝損傷、移植物抗宿主病和風(fēng)濕免疫疾病[4-5]。BMMSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力的機(jī)制尚不清楚，一些研究都提示，間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力需要受到干擾素γ (interferon-γ，IFN-γ)的激活[6-7]，但是另一些研究則未能得出類似結(jié)論[8-9]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指利用與靶基因同源的雙鏈RNA(double-strand RNA，dsRNA)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后的mRNA分解，從而抑制靶基因表達(dá)，該基因在mRNA水平失活而不是刪除編碼該基因的DNA。與傳統(tǒng)的基因敲除方法相比，RNA干擾更容易在高等真核細(xì)胞中誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)，RNAi技術(shù)還可下調(diào)單個(gè)基因的表達(dá)，是研究基因生物學(xué)功能的有力工具[10]。短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA)是常用的誘導(dǎo)目的mRNA降解的RNA干擾工具。本實(shí)驗(yàn)利用pSicoR-Ef1a-mCh-Puro慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默大鼠BMMSCs干擾素γ受體(interferon-γ receptor，IFN-γR)基因，進(jìn)一步分析沉默間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γR基因表達(dá)對(duì)其免疫調(diào)節(jié)能力的影響[11]。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及細(xì)胞

Wistar雄性大鼠，體重190～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為No.44005800005550；Tran5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Transgene；293T細(xì)胞株購(gòu)自ATCC；pSicoR-Ef1a-mCh-Puro購(gòu)自Invitrogen。

2 主要試劑

LB培養(yǎng)基(生工生物)；T4磷酸化酶、T4連接酶、HpaI和XhoI(NEB)；pLV-gene(表達(dá)紅色熒光蛋白R(shí)FP)、pGag/Pol、pRev、pVSV-G、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25% Trypsin-EDTA(1×)、Lipofectamine 2000 transfection reagent、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)試劑盒(Invitrogen)；Opti-MEM I(1×)和Reduced serum medium(Gibco)；polybrene、植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)、IFN-γ、MTT、白細(xì)胞介素10(interleukin-10, IL-10)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) ELISA試劑盒(Sigma)。

3 主要方法

3.1大鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取Wistar大鼠1只，頸椎脫臼法處死，于75%乙醇中浸泡約10 min，無(wú)菌手術(shù)取出雙側(cè)股骨及脛骨。取5 mL注射器，在股骨及脛骨兩端各打3個(gè)孔，注射器吸取5 mL培養(yǎng)基，插入股骨或脛骨干骺端，將細(xì)胞沖洗至培養(yǎng)皿中，反復(fù)多次，直至股骨及脛骨發(fā)白。以200目金屬濾網(wǎng)過(guò)濾沖洗液，將過(guò)濾后細(xì)胞懸液收集至離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清，加人適量DMEM培養(yǎng)基混勻，接種于2個(gè)25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)48～72 h后更換培養(yǎng)基，約于10～12 d長(zhǎng)滿約70%～80%瓶底后可用0.125%Trypsin-EDTA消化，1∶2傳代培養(yǎng)。

3.2目的干擾片斷的選擇 針對(duì)大鼠IFN-γR基因的核苷酸序列，利用Invitrogen公司shRNA在線設(shè)計(jì)工具h(yuǎn)ttp://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/設(shè)計(jì)合成1條shRNA單鏈寡核苷酸片段，兩端含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HpaI和XhoI。

3.3shIFNγR-LV慢病毒載體的構(gòu)建 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建能沉默IFN-γR基因的慢病毒shIFNγR-LV。簡(jiǎn)述如下：將pSicoR-Ef1a-mCh-Puro慢病毒載體以HpaI和XhoI雙酶切后，在T4連接酶作用下，與雙鏈DNA Oligo于4 ℃連接反應(yīng)12 h，制備克隆連接液，轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因鑒定。以Lipofectamine 2000介導(dǎo)進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝。轉(zhuǎn)染前24 h，用胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，傳代到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為Reduced serum medium。向一個(gè)滅菌離心管中加入所制備的DNA 溶液(pLV-gene載體10 μg，pGag/Pol載體5 μg、pRev載體5 μg、pVSV-G載體5 μg)，與相應(yīng)體積的Opti-MEM 混合均勻，調(diào)整總體積為1.5 mL。取60 μL Lipofectamine 2000試劑在另一管中與1.5 mL Opti-MEM混合，在室溫下溫育5 min。把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩?；旌虾?，在室溫下溫育20 min。將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后吸去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基10 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清液，于4 ℃、4 000×g離心10 min，除去細(xì)胞碎片。以 0.45 μm濾器過(guò)濾上清液于50 mL離心管中。把病毒粗提液樣品加入到過(guò)濾杯中，蓋上蓋子。將過(guò)濾杯插到濾過(guò)液收集管中，5 000×g離心15 min，至需要的病毒濃縮體積。離心結(jié)束后，過(guò)濾杯中的即為病毒濃縮液，-80 ℃保存。同樣方法制備僅含RFP報(bào)告基因的陰性對(duì)照慢病毒SicoR-NC-LV。

3.4慢病毒滴度測(cè)定 稀釋法測(cè)定病毒滴度。測(cè)定前一天，293T細(xì)胞鋪96孔板，每孔加4×104個(gè)細(xì)胞，體積為100 μL。準(zhǔn)備10個(gè)無(wú)菌的離心管。在每個(gè)管中加入90 μL無(wú)血清培養(yǎng)基。將病毒原液10 μL加入到第一個(gè)管中，記為1E+1；混勻后，取10 μL加入到第二個(gè)管中，記為1E+0。以此類推，繼續(xù)相同的操作直到最后一管。選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 μL培養(yǎng)基丟棄。加入90 μL稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后加入完全培養(yǎng)基100 μL。4 d后拍照觀察熒光表達(dá)情況。

3.5慢病毒感染大鼠BMMSCs 感染前，37 ℃水浴融化病毒，用培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋。加入polybrene，搖勻。常規(guī)方法檢測(cè)感染復(fù)數(shù)值(multiply of infection, MOI)。BMMSC-shIFNγR組取shIFNγR-LV按照最適MOI值感染大鼠BMMSCs(BMMSC-NC組添加病毒SicoR-NC-LV作為對(duì)照)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72 h，熒光顯微鏡下拍照觀察，RFP陽(yáng)性率>95%。

3.6慢病毒感染大鼠BMMSCs后IFN-γR mRNA的real-time PCR檢測(cè) 分別以shIFNγR-LV和對(duì)照病毒SicoR-NC-LV感染BMMSCs，72 h后收集細(xì)胞，按照試劑盒提取RNA以及逆轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)行real-time PCR，擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)條件：熱變性95 ℃ 120 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40循環(huán)。2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。

3.7BMMSCs和脾淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照(control)組(淋巴細(xì)胞+PHA)；BMMSC-NC組(IFN-γ+BMMSCs+SicoR-NC-LV+淋巴細(xì)胞+PHA)；BMMSC-shIFNγR組(IFN-γ+BMMSCs+shIFNγR-LV+淋巴細(xì)胞+PHA)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。常規(guī)方法制備大鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×109/L備用。以含IFN-γ(5×105U/L)的培養(yǎng)基處理BMMSCs(添加shIFNγR-LV或SicoR-NC-LV)5 d后，將BMMSCs消化、洗滌并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107L，接種于96 孔板，每孔100 μL。72 h待其貼壁后，以每孔5 μL的絲裂霉素(濃度為1 g/L)處理，37 ℃，30 min。吸去絲裂霉素并清洗干凈，在相應(yīng)組加入備用的淋巴細(xì)胞懸液90 μL及PHA(濃度為0.1 g/L)10 μL以刺激淋巴細(xì)胞增殖。37 ℃、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。

3.8標(biāo)本的收集和檢測(cè) (1)脾淋巴細(xì)胞活力的檢測(cè)：各組BMMSCs和脾淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)72 h后加入MTT(5 g/L)，每孔20 μL。37 ℃，繼續(xù)孵育4 h，500 r/min離心10 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm處讀取吸光度(A)值。(2)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的檢測(cè)：各組BMMSCs和脾淋巴細(xì)胞的混合培養(yǎng)72 h后，收集上層培養(yǎng)基，4 ℃、1 000×g條件下離心10 min，取上清，分裝后標(biāo)記，立即凍存于-80 ℃冰箱。采用ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別檢測(cè)各組上清液中IL-10及TNF-α的水平。于酶標(biāo)儀450 nm處讀A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各因子濃度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析結(jié)果。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。做方差齊性檢驗(yàn)。兩組比較采用t檢驗(yàn)；多組間兩兩比較采用方差分析，使用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)行均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 shIFNγR-LV慢病毒載體的構(gòu)建

運(yùn)用Invitrogen提供的RNA干擾設(shè)計(jì)工具，并結(jié)合RNA干擾設(shè)計(jì)的原則，尋找合適的靶序列。將編碼siRNA的DNA片段設(shè)計(jì)成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩端含限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HpaI和XhoI。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建包含有沉默IFN-γR基因的慢病毒載體shIFNγR-LV。shIFNγR序列為 5’-GTTAACAACTGCCTGCGCCAACAAATGTTCTTTCAAGAGAA-GAACATTTGTTGGCGCAGGCTTTTTTCCTCGAG-3’。

2 shIFNγR-LV慢病毒滴度測(cè)定

熒光顯微鏡下見(jiàn)不同程度的紅色熒光，證實(shí)已有病毒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少，觀察每孔陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，利用公式計(jì)算病毒滴度(TU/mL)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/病毒原液量，所得shIFNγR-LV滴度為2×108TU/mL，可滿足實(shí)驗(yàn)要求，見(jiàn)圖1。

3 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染大鼠BMMSCs

按照說(shuō)明書(shū)，將shIFNγR-LV以及對(duì)照病毒SicoR-NC-LV轉(zhuǎn)染BMMSCs。在熒光顯微鏡下觀察，293T細(xì)胞都能夠表達(dá)RFP，顯示較強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)。RFP陽(yáng)性率>95%，見(jiàn)圖2。

4 shIFNγR-LV下調(diào)BMMSCs的IFN-γR mRNA表達(dá)

將shIFNγR-LV和SicoR-NC-LV分別轉(zhuǎn)染大鼠BMMSCs，real-time PCR檢測(cè)BMMSC-NC組和BMMSC-shIFNγR組IFN-γR mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示BMMSC-NC組IFN-γR的mRNA表達(dá)水平明顯高于BMMSC-shIFNγR組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 1.Detection of shIFNγR-LV concentration with dilution method (4 d after transfection；n=5； ×200).

圖1稀釋法測(cè)定shIFNγR-LV滴度

Figure 2.Fluorescence detection of BMMSCs transfected with shIFNγR-LV or SicoR-NC-LV (72 h after transfection；n=5； ×200). BMMSCs in BMMSC-shIFNγR group were transfected with shIFNγR-LV, and BMMSCs in BMMSC-NC group were transfected with SicoR-NC-LV.

圖2BMMSCs轉(zhuǎn)染shIFNγR-LV或SicoR-NC-LV后熒光檢測(cè)

5 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

對(duì)照組、BMMSC-NC組和BMMSC-shIFNγR組大鼠BMMSCs與大鼠脾淋巴細(xì)胞混合共孵育72 h，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,BMMSC-NC組、BMMSC-shIFNγR組和對(duì)照組的A值分別為0.656±0.008、0.753±0.013和0.801±0.787。BMMSC-NC組的A值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，顯示了BMMSCs能抑制淋巴細(xì)胞的活力；BMMSC-NC組A值低于BMMSC-shIFNγR組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染shIFNγR-LV后，BMMSCs細(xì)胞表面缺乏IFN-γ受體，抑制了IFN-γ信號(hào)通路，也抑制了BMMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力，見(jiàn)圖4。

Figure 3.IFN-γR mRNA relative expression. Mean±SD.n=5.*P<0.05 BMMSC-NC group.

圖3IFN-γRmRNA相對(duì)表達(dá)分析

Figure 4.The results of MTT assay for measuring mixed lymphocyte reaction. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsBMMSC-NC group.

圖4混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的MTT分析

6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)TNF-α和IL-10濃度的分析

混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系共孵育3 d 后，以ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10濃度。與對(duì)照組相比，BMMSC-NC組上清液中TNF-α濃度更低而IL-10 濃度更高(P<0.05)，顯示BMMSCs能抑制TNF-α的分泌，促進(jìn)IL-10分泌，減輕炎癥反應(yīng)，體現(xiàn)了BMMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力；和BMMSC-NC組相比，BMMSC-shIFNγR組上清液中TNF-α濃度更高，而IL-10濃度更低(P<0.05)，提示抑制BMMSCs的IFNγ信號(hào)通路會(huì)部分消除BMMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力，見(jiàn)圖5。

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞因?yàn)榈兔庖咴院投嘞蚍只芰?，在異體干細(xì)胞移植治療上有廣泛應(yīng)用前景。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞在移植物抗宿主病和免疫系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力日益受到重視。目前認(rèn)為，在間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝衰竭和移植物抗宿主病等疾病時(shí)，是免疫調(diào)節(jié)能力，而不是多向分化能力起主要作用。雖然間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力得到廣泛的認(rèn)可，但是具體發(fā)生機(jī)制尚不明確。雖然很多研究都提示IFN-γ信號(hào)通路在其中扮演重要角色，但是都缺乏充分依據(jù)[12]。本研究利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建一個(gè)能沉默間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γ受體基因的慢病毒載體，通過(guò)沉默間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γ受體基因，抑制IFN-γ信號(hào)通路的激活，最終觀察不同IFN-γ信號(hào)通路激活狀態(tài)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的影響。

針對(duì)IFN-γ受體的基因編碼序列，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了shIFNγR-LV慢病毒干擾載體，能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并能有效下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γ受體基因的表達(dá)水平，從而抑制間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γ信號(hào)通路活性，為研究IFN-γ信號(hào)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力發(fā)生機(jī)制中的作用提供重要研究工具。

Figure 5.Concentrations of IL-10 and TNF-α in supernatants of mixed lymphocyte reaction system. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsBMMSC-NC group.

圖5混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系上清液IL-10和TNF-α濃度

為了研究間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力，本研究進(jìn)行了混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力，有效抑制脾淋巴細(xì)胞的活力，這和多數(shù)研究報(bào)道一致[13]。沉默大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γR基因后，對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)抑制作用明顯減弱，顯示免疫調(diào)節(jié)能力的大幅下調(diào)，直接證實(shí)了IFN-γ信號(hào)通路對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力起到重要作用。進(jìn)一步對(duì)淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)體系炎癥因子的分析表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力與TNF-α濃度降低以及IL-10的濃度升高有關(guān)，體現(xiàn)了抑制免疫炎癥反應(yīng)的作用[14]。而以RNA干擾技術(shù)抑制間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γ信號(hào)通路后，間充質(zhì)干細(xì)胞降低TNF-α濃度、提高IL-10濃度的能力下降，直接表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)能力的下調(diào)。

本研究中，無(wú)論是對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制還是對(duì)炎癥因子的影響，沉默間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γR基因并不能完全阻斷間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。原因是多方面的：一方面所構(gòu)建的shIFNγR-LV慢病毒干擾載體并不能完全沉默間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γR基因，導(dǎo)致IFN-γ信號(hào)通路的激活不能完全被抑制；另一方面，除了IFN-γ信號(hào)通路，間充質(zhì)干細(xì)胞可能也存在其它替代通路來(lái)激活其免疫調(diào)節(jié)能力，雖然這些替代通路所激活的免疫調(diào)節(jié)能力弱于IFN-γ信號(hào)通路的激活作用。

本研究通過(guò)利用RNA干擾技術(shù)，成功沉默間充質(zhì)干細(xì)胞IFN-γR基因。抑制IFN-γ信號(hào)通路可以下調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力，進(jìn)一步揭示的IFN-γ信號(hào)通路在間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中重要作用，但是其中的具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。