外泌體在心力衰竭中的研究進(jìn)展*

紀(jì)細(xì)心， 劉劍， 張文超， 陳碩， 周銳飛， 董一飛

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(江西南昌 330006)

心力衰竭是泵功能和(或)充盈功能障礙引起體循環(huán)和(或)肺循環(huán)淤血的臨床綜合征，是高發(fā)生率、高致殘、高病死率性疾病，隨著人口老齡化，其數(shù)目在不斷增長，全世界約有3 800萬人患有心力衰竭[1]。因而洞悉心力衰竭發(fā)病機(jī)制為臨床治療提供良好的治療方案亟待解決，傳統(tǒng)機(jī)制包括交感神經(jīng)異常激活、腎素-血管緊張素醛固酮系統(tǒng)、炎癥氧化應(yīng)激等。近年來隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶microRNA、mRNA、線粒體DNA(mtDNA)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種活性物質(zhì)，且參與多系統(tǒng)信息交流和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。外泌體在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[2-3]，而心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段，這激起人們研究外泌體在心力衰竭中作用的熱情，為心力衰竭發(fā)病機(jī)制及治療提供新的方向和指導(dǎo)。

1 外泌體基本生物學(xué)特征

1.1 外泌體形成、來源及其內(nèi)容物 在20世紀(jì)80年代，Johnstone等[4]發(fā)現(xiàn)網(wǎng)織紅細(xì)胞在成熟過程中分泌的小囊泡可以傳遞轉(zhuǎn)鐵蛋白，并首次將這種囊泡亞型命名為exosome(外泌體)。不同于微粒和凋亡小體(其他兩種常見細(xì)胞外囊泡)直接由質(zhì)膜脫落形成，外泌體是由細(xì)胞膜內(nèi)出芽過程的開始而形成早期核內(nèi)體，接著早期核內(nèi)體再次內(nèi)出芽形成各種管腔內(nèi)囊泡，形成晚期核內(nèi)體，包含腔內(nèi)囊泡的晚期核內(nèi)體稱為多囊泡體，多囊泡體被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解，或者多囊泡體與細(xì)胞質(zhì)膜融合從而將其內(nèi)容物釋放到胞外環(huán)境中，所釋放的腔內(nèi)囊泡為外泌體[5]。隨后發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、心肌細(xì)胞等)可以分泌外泌體，廣泛存在于血液、尿液、膽汁、唾液等生物體液[6-8]，隨循環(huán)在體內(nèi)流動，被靶細(xì)胞攝取產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，這不禁讓人們對外泌體的內(nèi)含物產(chǎn)生極大的興趣。截止目前，發(fā)現(xiàn)外泌體已有9 769種蛋白質(zhì)，3 408種mRNA，2 838種microRNA及1 116種脂類(http://www.exocarta.org/)，還有一些正在被發(fā)現(xiàn)中。普遍認(rèn)為外泌體的標(biāo)志蛋白包括熱休克蛋白、四跨膜蛋白家族、多囊泡胞內(nèi)體產(chǎn)生相關(guān)蛋白(Alix，Tsg101)、GTPaseRAB家族等[9]，這些成分多與外泌體的形成和起源有關(guān)。

1.2 外泌體發(fā)揮效應(yīng)的機(jī)制 外泌體是機(jī)體細(xì)胞主動分泌的，無免疫原性，通過自分泌、旁分泌、遠(yuǎn)分泌方式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10-11]，與靶細(xì)胞作用方式如下：(1)配體(即外泌體)與靶細(xì)胞膜蛋白受體相結(jié)合進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；(2)外泌體與靶細(xì)胞膜融合，釋放其內(nèi)容物到靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)生效應(yīng)作用；(3)外泌體被內(nèi)吞影響靶細(xì)胞功能[12]。上述機(jī)制可能單一發(fā)生或者混合發(fā)生，細(xì)胞在不同應(yīng)激狀態(tài)，其機(jī)制可能會發(fā)生變化，這需進(jìn)一步研究探討，從而便于人們干預(yù)某個環(huán)節(jié)為臨床服務(wù)。

2 外泌體與心力衰竭

基于外泌體的獨(dú)特生物學(xué)特征，近年來發(fā)現(xiàn)外泌體參與心臟中細(xì)胞間的交流。除此之外，外泌體不僅體現(xiàn)心力衰竭的病理狀態(tài)，而且存在于體液中可多次重復(fù)獲取，使它成為心血管損傷的潛在標(biāo)記物。另一方面外泌體參與心臟的病理性重塑，這為心力衰竭發(fā)病機(jī)制提供新的干預(yù)方向。

2.1 外泌體參與細(xì)胞間交流 心臟是由心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)維持心臟正常形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能，這些細(xì)胞能分泌細(xì)胞因子促進(jìn)彼此間交流。此外發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞能主動分泌外泌體參與心臟調(diào)節(jié)。心臟肥大常由壓力負(fù)荷過重導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)變化，在肥大發(fā)生過程中，多種細(xì)胞通過外泌體攜帶microRNA及蛋白質(zhì)向心肌細(xì)胞傳遞促肥大的信號分子。Bang等[13]表明心臟成纖維細(xì)胞來源的外泌體，攜帶“乘客”micro-21*(發(fā)現(xiàn)microRNA-21主要存在成纖維細(xì)胞中，micro-21*存在成纖維細(xì)胞分泌的外泌體中)，被心肌細(xì)胞攝取，靶向調(diào)節(jié)SORBS2和PDLIM5促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。在動物實(shí)驗(yàn)中通過注射micro-21*抑制劑逆轉(zhuǎn)了微泵注射血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)心臟肥大效應(yīng)。另外AngⅡ預(yù)處理成纖維細(xì)胞，其分泌的外泌體攜帶高水平的腎素、血管緊張素原、血管緊張素1受體(AT1R)、血管緊張素2受體(AT2R)，被心肌細(xì)胞內(nèi)吞，引起其血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2水平下調(diào)，產(chǎn)生和釋放更多的AngⅡ，且上調(diào)AT1R、AT2R表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大[14]。這都表明外泌體以旁分泌方式對心臟細(xì)胞間信息交流發(fā)揮重要作用。除此之外，小兒擴(kuò)張型心肌病來源的血漿與人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞或初生大鼠心室肌細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病來源的血漿影響心肌細(xì)胞B型利鈉肽(BNP)基因的異常表達(dá)，研究證實(shí)該效應(yīng)主要來源于血漿中外泌體，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該效應(yīng)與外泌體數(shù)量關(guān)聯(lián)不大，主要是其攜帶的內(nèi)容物發(fā)揮的作用[15]。

外泌體同時參與內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)。16 kD催乳素刺激內(nèi)皮細(xì)胞使其主動分泌攜帶microRNA-146a的外泌體，以自分泌作用的方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖，導(dǎo)致圍生期心肌病血管生成異常[16]。與其相反，心肌球細(xì)胞主動分泌攜帶microRNA-146a的外泌體促進(jìn)心肌梗死后心臟血管生成和心臟功能的改善。因此，外泌體在不同病理?xiàng)l件下可能參與不同的信號通路調(diào)節(jié)，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究[17]。高糖環(huán)境阻礙心臟血管生成。在大鼠2型糖尿病模型中分離的心肌細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)其抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管型形成的能力，研究發(fā)現(xiàn)這與病理狀態(tài)下的心肌細(xì)胞分泌攜帶microRNA-320的外泌體有關(guān)[18]。

2.2 外泌體是心血管損傷的潛在標(biāo)記物 心力衰竭是多種心血管疾病的失代償階段，發(fā)病率逐年上升，病死率居高不下。對心力衰竭患者而言，早期正確的診治以延長患者生命、改善生存質(zhì)量，而生物學(xué)標(biāo)記物在心力衰竭的診斷和預(yù)后中發(fā)揮著重要的作用。常見生物學(xué)標(biāo)記物包括BNP、半乳凝集素-3、肌鈣蛋白等。雖然這些生物學(xué)標(biāo)記物有一些優(yōu)勢，在心力衰竭患者危險分層和其他影響因素下仍存在明顯局限性。比如BNP是慢性心力衰竭患者最常用的生物學(xué)標(biāo)記物，用于診斷心力衰竭和判斷其嚴(yán)重程度，但肥胖、慢性腎功能不全、肺臟疾病等影響其準(zhǔn)確性，此外某些臨床情況下BNP不能判斷住院死亡率或者臨床結(jié)局[19]。近年來發(fā)現(xiàn)外泌體在不同疾病狀態(tài)下攜帶的物質(zhì)發(fā)生改變，參與心室重塑和血管功能異常[20]。在黏液樣退行性二尖瓣病變繼發(fā)心力衰竭犬模型中，通過檢測正常對照組、黏液性退行性二尖瓣膜病變組(MMVD)、黏液性退行性二尖瓣病變心力衰竭組(MMVD-CHF)血漿及血漿中外泌體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿中外泌體microRNA比血漿總microRNA更能體現(xiàn)疾病狀態(tài)，而且不同階段狀態(tài)下外泌體攜帶的microRNA發(fā)生變化，比如正常對照組(micro-9、micro-495和micro-599)比較，MMVD(micro-9增加、micro-599下降)，MMVD-CHF(micro-181c、micro-495均增加)，因而更體現(xiàn)疾病狀態(tài)下特異性[21]。此外，外泌體廣泛存在于體液，穩(wěn)定且易多次重復(fù)獲取，這使外泌體有可能成為心力衰竭患者預(yù)后的一種潛在標(biāo)志物。Matsumoto等[22]表明外泌體攜帶microRNA能預(yù)測急性心肌梗死后發(fā)生缺血性心肌病的風(fēng)險。他們檢測急性心肌梗死后1年內(nèi)發(fā)生心力衰竭患者血漿中377種microRNA，發(fā)現(xiàn)P53調(diào)控性的microRNA-192、microRNA-194、microRNA-34水平明顯升高，且富集在外泌體，并與患者急性心肌梗死1年后發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險密切相關(guān)，提示血漿外泌體變化或者聯(lián)合其他生物標(biāo)記物有可能幫助臨床醫(yī)護(hù)人員對心力衰竭進(jìn)行早期干預(yù)，延緩疾病進(jìn)展，改善患者生存質(zhì)量。當(dāng)然，對于外泌體作為心力衰竭標(biāo)志物仍需大樣本量、前瞻性的臨床實(shí)驗(yàn)予以進(jìn)一步證實(shí)。

2.3 外泌體參與心臟炎癥和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié) 炎癥在心力衰竭中扮演著不可忽視的作用。心力衰竭患者血漿和心臟的炎性細(xì)胞因子水平升高。很多研究表明慢性心力衰竭嚴(yán)重程度與血漿炎性細(xì)胞因子密切相關(guān)。近年來研究表明microRNA可調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。血漿中炎癥因子、microRNA可以被包裹在外泌體中傳遞給靶細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)。microRNA-146a是心肌高表達(dá)的microRNA，能在血漿或者外泌體中被檢測到，參與細(xì)胞存活和免疫炎癥調(diào)節(jié)[23]。Beg等[24]檢測慢性心力衰竭患者和健康對照組的血漿總microRNA和血漿中外泌體microRNA變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶microRNA-146a比血漿總microRNA-146a與慢性心力衰竭關(guān)聯(lián)更強(qiáng)。研究者在近期的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭患者血漿中炎性細(xì)胞因子(IL-1β和IL-8)水平明顯升高，同時發(fā)現(xiàn)這些心力衰竭患者血漿中攜帶mtDNA的外泌體水平也更高[25]。為了進(jìn)一步探討其機(jī)制，在體外實(shí)驗(yàn)中，用心力衰竭患者的血漿外泌體刺激人外周血單核細(xì)胞(THP-1)，證實(shí)了THP-1細(xì)胞通過mtDNA/TLR-9/NF-κB信號通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子，這些升高的炎性細(xì)胞因子與外泌體攜帶的mtDNA拷貝數(shù)相關(guān)[25]。因此，調(diào)控富含mtDNA的外泌體可能為慢性心力衰竭患者提供靶向治療。

氧化應(yīng)激可引起大分子損傷和擾亂氧化還原信號通路，影響心臟結(jié)構(gòu)和功能。核轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激體系中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2 核轉(zhuǎn)位并且結(jié)合核酸序列上的抗氧化反應(yīng)元件ARE(即Nrf2-ARE信號通路)在細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷防護(hù)中發(fā)揮重要作用。最近研究表明外泌體攜帶microRNA-27a、-28-3p和-34a引起心臟Nrf2蛋白翻譯異常，擾亂Nrf2-ARE信號通路，導(dǎo)致慢性心力衰竭的發(fā)展[26]。因此，調(diào)控富含以上microRNA的血漿外泌體可能是心力衰竭治療中另一個潛在靶點(diǎn)[26]。

3 外泌體在心力衰竭治療中的前景

3.1 干細(xì)胞源性外泌體 干細(xì)胞分化為新的心肌細(xì)胞改善心臟功能，是心臟再生學(xué)中的熱點(diǎn)。干細(xì)胞移植增強(qiáng)左室射血分?jǐn)?shù)、增加血管密度及改善心肌灌注的作用，越來越多的研究提示這些有益作用是干細(xì)胞旁分泌的活性物質(zhì)發(fā)揮的生物效應(yīng)。有研究利用急性心肌梗死動物模型，與未處理比較，間充質(zhì)干細(xì)胞移植明顯改善心肌梗死3 d后的心臟功能，且如此短期移植的間充質(zhì)干細(xì)胞未分化為心肌細(xì)胞，這提示有其他機(jī)制參與心臟的修復(fù)[27]。在缺氧的環(huán)境下間充質(zhì)干細(xì)胞可以旁分泌更多的活性物質(zhì)，用其分泌的活性物質(zhì)經(jīng)冠脈注射來治療缺血再灌住損傷的心臟，結(jié)果明顯改善心臟功能、減少梗死面積[28]。此外Uemura[29]研究顯示，缺氧預(yù)處理的骨髓干細(xì)胞治療急性心肌梗死后缺血型心肌病，與正常含氧的骨髓干細(xì)胞比較，兩者分化為心肌細(xì)胞的數(shù)目相似，但缺血預(yù)處理的骨髓干細(xì)胞明顯改善心臟結(jié)構(gòu)和功能(左室舒張和收縮末徑減小、室壁增厚、梗死面積縮小、射血分?jǐn)?shù)增強(qiáng))。在體外實(shí)驗(yàn)中，與未處理的骨髓干細(xì)胞比較，缺血預(yù)處理的骨髓干細(xì)胞增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗凋亡的能力，這效應(yīng)主要來源于其分泌更多活性物質(zhì)。進(jìn)一步研究顯示干細(xì)胞分泌的這些活性物質(zhì)主要是外泌體[30-31]。在一項(xiàng)研究中，利用急性心肌梗死誘發(fā)慢性心力衰竭的動物模型，與對照組比較，人胚胎干細(xì)胞源性心血管祖細(xì)胞(human embryonic stemcell-derived cardiovascular progenitors，hESC-Pg)處理該動物模型6周后能顯著減少左心室收縮末期容積、左心室舒張末期容積，減少梗死面積，提高左心室射血分?jǐn)?shù)[32]。更有趣的是，發(fā)現(xiàn)來源于hESC-Pg的細(xì)胞外囊泡(主要是外泌體)處理上述動物模型能產(chǎn)生同等程度的心臟保護(hù)作用[32]。為了證實(shí)其發(fā)揮作用的成分，檢測了hESC-Pg及其來源的細(xì)胞外囊泡(主要是外泌體)處理組的心臟基因芯片，與對照組比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者心臟有927個基因上調(diào)，上調(diào)的49個基因與心臟功能(或者心臟再生)相關(guān)，相關(guān)中的78%與增加細(xì)胞存活/增殖、DNA修復(fù)、減少纖維化改善心力衰竭相關(guān)信號通路相關(guān)。這在一定程度上表明外泌體攜帶其母細(xì)胞的特征，在治療上安全有效，這無疑促進(jìn)干細(xì)胞來源外泌體成為心力衰竭治療的新藥物。當(dāng)然外泌體治療研究仍局限在動物水平，其臨床治療仍在不斷努力探索中。

3.2 缺血預(yù)處理源性外泌體 缺血預(yù)處理在心臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，而在慢性心力衰竭中的作用研究甚少。有研究顯示，與對照組比較，慢性缺血性心力衰竭患者予以上臂缺血預(yù)處理(短暫缺血5 min繼之再灌注5 min，進(jìn)行4個循環(huán)，1次/d，持續(xù)4周左右)，并不能改善左心室收縮力，但可顯著改善患者的骨骼肌功能，同時降低患者血壓和血漿NT-proBNP水平[33]。Yamaguchi等[34]研究顯示，雙后肢缺血預(yù)處理急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型(短暫缺血5 min繼之再灌注5 min，1次/d，進(jìn)行4個循環(huán)，持續(xù)4周)，發(fā)現(xiàn)較未處理組，心肌纖維化和血清氧化應(yīng)激水平下降，同時缺血預(yù)處理組左心室收縮末期容積和舒張末期容積顯著降低，舒張功能和射血分?jǐn)?shù)顯著改善。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)雙后肢缺血預(yù)處理大鼠可誘導(dǎo)骨骼肌分泌外泌體到循環(huán)，使血漿外泌體水平明顯升高，外泌體攜帶microRNA-29a和胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)遞送到心臟，最終改善心臟功能。

4 展望

自發(fā)現(xiàn)外泌體以來，關(guān)于外泌體的研究層出不窮，特別是近年來外泌體在心血管疾病中研究受到越來越多的關(guān)注。結(jié)合前述所知，外泌體參與心臟中的細(xì)胞交流，這讓人們開始探索外泌體在心力衰竭發(fā)生發(fā)展中的作用。此外，與干細(xì)胞比較，外泌體有易保存、可重復(fù)獲取且無免疫排斥等特點(diǎn)，因此在治療中體現(xiàn)出更大的潛在優(yōu)越性。另一方面，目前外泌體相關(guān)研究仍存在很多不完善的地方，比如外泌體的提取純度、外泌體的半衰期、外泌體/人工包裝修飾外泌體靶向性等問題。然而，盡管心血管相關(guān)外泌體的研究仍處于初級階段，越來越多的研究已經(jīng)表明外泌體在心力衰竭病理生理中扮演著極其重要的角色。