顆粒細胞復(fù)合體在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中作用的研究

惠董娜，任文娟，馮曉琴，雷鑫，王治平，劉建榮，李弘

(山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，太原 030012)

人卵母細胞體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation，IVM)自1991年獲得首次成功妊娠后，取得了飛速發(fā)展，臨床上已不僅限于多囊卵巢綜合征(PCOS)的患者，而且在卵巢高/低反應(yīng)患者、癌癥患者生育力保存等方面也有了一定的應(yīng)用[1]。目前，全世界范圍內(nèi)應(yīng)用IVM技術(shù)出生的健康嬰兒大約有5 000個，臨床妊娠率可達到35%～40%[2]。雖有研究報道人未成熟卵母細胞經(jīng)IVM后的成熟率可達70%，但IVM卵母細胞的發(fā)育潛能仍低于體內(nèi)成熟的卵母細胞，表現(xiàn)在受精后卵裂率低、囊胚形成率和種植率低等方面[3]，成為限制該技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展的重要因素之一?，F(xiàn)有的培養(yǎng)體系多為單純添加一些物質(zhì)，難以達到卵母細胞IVM的最佳條件，影響卵母細胞IVM及隨后的發(fā)育潛能[4]。本研究通過在培養(yǎng)液中添加成熟卵母細胞的顆粒細胞復(fù)合體，建立共培養(yǎng)體系，模擬體內(nèi)卵母細胞生長的微環(huán)境，探索更適合ICSI-ET周期中卵母細胞IVM的培養(yǎng)條件，以期取得更好的IVM效果。

資料與方法

一、研究對象

根據(jù)《臨床診療指南-輔助生殖技術(shù)與精子庫分冊》的標準，收集2015年1月至2017年6月在我院生殖醫(yī)學(xué)科接受ICSI-ET治療的156例不育患者促排卵周期中廢棄的未成熟卵母細胞為研究對象?；颊吣挲g21～38歲，平均年齡(29.96±4.37)歲，不孕年限1～10年，平均年限(3.82±2.67)年，治療指征包括輸卵管阻塞、少弱畸精子癥和無精子癥等。排除PCOS及子宮內(nèi)膜異位癥患者。本研究獲得山西省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，經(jīng)患者知情同意后簽字進入本研究。

二、方法

1.卵母細胞采集：采用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，注射用醋酸曲普瑞林，輝凌制藥，德國)和促性腺激素(FSH/HMG，果納芬，雪蘭諾，瑞士)聯(lián)合長/短方案及微刺激方案。卵泡直徑達到18 mm后，肌注HCG，36 h后B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，采集卵冠丘復(fù)合體(OCCC)，取發(fā)育未成熟卵母細胞用于實驗。

2.收集未成熟卵母細胞：符合研究標準且擬行ICSI-ET治療的患者，取卵日收集OCCC后繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后，用透明質(zhì)酸酶80 U/ml(Quinn’s，SAGE，美國)處理OCCC，以機械法剝除卵丘顆粒細胞，在倒置鏡下觀察卵母細胞成熟度。剝除卵丘顆粒細胞的卵母細胞按成熟度分為：MⅡ期，即成熟卵母細胞，可見第一極體；MⅠ期，無第一極體也無生發(fā)泡；GV期，可見生發(fā)泡，收集MⅠ期、GV期卵母細胞用于IVM培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)液及顆粒細胞復(fù)合體的準備：(1)IVM培養(yǎng)液的配制：HTF培養(yǎng)基+10%SPS+20%hFF +75 U/L FSH+75 U/L LH，充分混勻并用0.22 μm過濾器過濾，制成30 μl微滴置于共培養(yǎng)皿微孔中，覆蓋礦物油，置于5%CO2培養(yǎng)箱中平衡；(2)卵丘顆粒細胞復(fù)合體的剝離：選取同一患者呈旭日狀、放射冠與卵丘界限分明且具有粘附培養(yǎng)皿傾向的成熟的高質(zhì)量卵母細胞，體視顯微鏡下(20×)用1 ml注射器前端針尖切割部分卵丘顆粒細胞團塊組織，測微尺測量卵丘顆粒細胞團在500 μm，巴氏德吸管吸出，在未成熟卵母細胞培養(yǎng)液中洗滌數(shù)次，置于未成熟卵共培養(yǎng)皿微滴中。

4.未成熟卵母細胞分組及培養(yǎng)：將收集到的MⅠ、GV期未成熟卵母細胞以隨機方式分組到對照組(C組，培養(yǎng)時不添加顆粒細胞復(fù)合體)和實驗組(T組，培養(yǎng)時添加顆粒細胞復(fù)合體)中進行培養(yǎng)，并按照MⅠ期和GV期未成熟卵母細胞的不同分為4個亞組：MⅠ-C組、MⅠ-T組和GV-C組、GV-T組。對照組是將隨機入組的未成熟卵母細胞置于IVM培養(yǎng)液配制的共培養(yǎng)皿微滴中；實驗組將隨機入組的未成熟卵母細胞置于IVM培養(yǎng)液配制的共培養(yǎng)皿微滴中，并加入同一患者的成熟卵母細胞的顆粒細胞復(fù)合體，將上述分組的未成熟卵母細胞置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5.ICSI及胚胎培養(yǎng)：分別于培養(yǎng)后24 h、48 h觀察卵母細胞的成熟情況，以排出第一極體為準，判斷為成熟的MⅡ期卵母細胞，取出24 h成熟的卵母細胞后進行ICSI方式受精，受精后轉(zhuǎn)入含卵裂液的胚胎培養(yǎng)皿中，在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第6 d，觀察并記錄胚胎發(fā)育情況。ICSI所用精子來自于同一患者前一日受精后留存的精子或當(dāng)日IVF/ICSI受精后患者廢棄的精子。卵裂期胚胎評分按照我科常規(guī)進行[5]，囊胚期評分采用Gardner標準[6]。

6.觀察指標：觀察體外培養(yǎng)未成熟卵母細胞的成熟率(培養(yǎng)成熟的MⅡ卵數(shù)/培養(yǎng)的卵母細胞數(shù))、正常受精率(2PN數(shù)/ICSI注射的卵母細胞數(shù))、受精數(shù)(2PN+1PN+3PN/ICSI注射的卵母細胞數(shù))、卵裂率(卵裂胚胎數(shù)/2PN 受精數(shù))、優(yōu)質(zhì)胚胎率(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù))以及囊胚形成率(囊胚數(shù)/可移植胚胎數(shù))。

三、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、未成熟卵母細胞IVM成熟情況的比較

本研究納入156例ICSI-ET患者，共收集到305枚未成熟卵母細胞，其中MⅠ期卵母細胞186枚，GV期卵母細胞119枚，以隨機方式入組到對照組(C組)和實驗組(T組)進行培養(yǎng)，MⅠ-C組91枚、MⅠ-T組95枚、GV-C組59枚、GV-T組60枚。MⅠ-T組體外培養(yǎng)24 h成熟76枚(成熟率80.00%)顯著高于MⅠ-C組(P<0.05)；GV-T組體外培養(yǎng)24 h的成熟率與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。體外培養(yǎng)48 h后，MⅠ-T及GV-T組卵母細胞成熟率顯著高于同期對照組(P<0.01)(表1)。

表1 未成熟卵母細胞IVM情況比較[n(%)]

注：與同期C組比較，*P<0.05，**P<0.01

二、未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)24 h成熟后發(fā)育潛能的比較

體外培養(yǎng)24 h成熟的卵母細胞采用ICSI方式受精后觀察胚胎發(fā)育情況：(1)MⅠ-T組培養(yǎng)24 h成熟卵母細胞76枚，正常受精率69.74%(53/76)、受精率75.00%(57/76)及優(yōu)質(zhì)胚胎率35.56%(16/45)均顯著高于MⅠ-C組(P<0.05)；兩組的卵裂率比較無顯著性差異(P>0.05)。與MⅠ-C組比較，MⅠ-T組囊胚形成數(shù)有所增加，但尚無顯著性差異(P>0.05)；MⅠ-T組卵母細胞利用率21.05%(16/76)顯著高于MⅠ-C組(P<0.01)。(2)GV-T組與GV-C組的正常受精率、受精率及卵裂率比較均無顯著性差異(P>0.05)；GV-T組形成了1枚優(yōu)質(zhì)胚胎，但兩組均未發(fā)育成囊胚，因數(shù)量少未行統(tǒng)計學(xué)分析；與GV-C組比較，GV-T組有一定的卵母細胞利用率，未行統(tǒng)計學(xué)分析(表2)。

表2 未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)24 h成熟后發(fā)育潛能比較(%)

注：與同期C組比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

IVM技術(shù)在預(yù)防卵巢過度刺激、高劑量促性腺激素治療所帶來的風(fēng)險上有著很好的優(yōu)勢，已報道的IVM臨床妊娠率可達到45%～50%[7]，因此，更加深入地研究IVM可擴大該技術(shù)的應(yīng)用范圍。常規(guī)促排卵周期中約有15%～20%的未成熟卵母細胞[8]，通常會將其直接廢棄，增加了部分患者的周期取消率。若能將這些卵母細胞充分利用，就可為他們增加一些妊娠機會。目前，對促排卵周期聯(lián)合IVM的應(yīng)用存在一定的爭議，因促排卵周期中的未成熟卵母細胞經(jīng)過HCG扳機作用，阻斷了顆粒細胞上C型利鈉肽(CNP)前體的分泌，導(dǎo)致卵母細胞內(nèi)cAMP濃度降低，使減數(shù)分裂恢復(fù)啟動，胞核成熟快于胞質(zhì)的成熟[9-11]，不同于通常意義上的IVM；而IVF/ICSI-ET周期中IVM的臨床應(yīng)用價值有限，還是能夠挽救一部分卵母細胞，各方觀點不同[11-13]。本研究采集到305枚未成熟卵母細胞，MⅠ期及GV期卵母細胞經(jīng)IVM 48 h后分別獲得了88.42%和65.00%的成熟卵率，MⅠ期來源成熟的卵母細胞正常受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率有所增加，并有一定數(shù)量的囊胚形成。我們認為，體外促排卵周期中獲得的未成熟卵母細胞仍具有一定的發(fā)育潛能，可用來補充一次促排卵周期中胚胎的來源，提高卵母細胞的利用率。

IVM最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是通過調(diào)整培養(yǎng)條件以滿足卵母細胞成熟所需的營養(yǎng)物質(zhì)，進而促使卵母細胞恢復(fù)正常的減數(shù)分裂。目前，體外培養(yǎng)系統(tǒng)多以基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如TCMl99、Ham’s、HTF等)中添加血清、蛋白質(zhì)、促性腺激素(FSH和LH)、生長因子及類固醇激素等為主，可發(fā)育為MⅡ卵母細胞，但胚胎發(fā)育潛能較低[14]。近年來，培養(yǎng)體系研究已從單因素轉(zhuǎn)向多因素聯(lián)合，將卵丘顆粒細胞與未成熟卵母細胞體外共培養(yǎng)成為一個受關(guān)注的研究點。Jahromi等[15]將未成熟卵母細胞與顆粒細胞共培養(yǎng)的成熟率為84.28%，可利用胚胎率75.00%，表明顆粒細胞能夠提高卵母細胞成熟率和胚胎發(fā)育潛能。顆粒細胞共培養(yǎng)通過模擬體內(nèi)卵巢“微環(huán)鏡”，與卵母細胞構(gòu)成縫隙連接，通過雙向交流，調(diào)節(jié)其成熟和發(fā)育能力，并可獲得與體內(nèi)成熟卵母細胞更為相似的基因表達譜[16]。本研究實驗組中利用共培養(yǎng)皿上相互連通的培養(yǎng)孔建立了一個共培養(yǎng)體系，將剝離的顆粒細胞復(fù)合體置入以模擬體內(nèi)的生長環(huán)境，使顆粒細胞復(fù)合體發(fā)揮旁分泌和自分泌作用，促進卵母細胞成熟和進一步發(fā)育。體外培養(yǎng)48 h后，與同期對照組相比，MⅠ-T組和GV-T組的卵母細胞總成熟率(分別為88.42%和65.00%)顯著升高(P<0.01)。本研究進一步評估了成熟后卵母細胞的發(fā)育潛能，MⅠ期卵母細胞在含顆粒細胞復(fù)合體的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h的成熟率為80.00%、正常受精率69.74%、受精率75.00%及優(yōu)質(zhì)胚胎率35.56%均顯著高于對照組(P<0.05)，且囊胚形成數(shù)也有所增加，表明顆粒細胞復(fù)合體在卵母細胞成熟中發(fā)揮著一定的作用。本研究中，MⅠ-T組的卵母細胞亦獲得了較好的卵母細胞利用率，與之前報道的研究結(jié)果[4]相似。GV期卵母細胞培養(yǎng)24 h后，GV-T和GV-C兩組間各指標比較均無顯著性差異(P>0.05)，GV期卵母細胞雖能發(fā)育成熟，但未能形成囊胚，添加顆粒細胞復(fù)合體的培養(yǎng)體系效果不夠理想。推測其可能的原因有：(1)促排卵周期中大劑量促性腺激素的作用，使得GV期卵母細胞發(fā)育受到主導(dǎo)卵泡的影響；(2)本研究中的培養(yǎng)條件還不足以滿足GV期卵母細胞胞質(zhì)的成熟，可能與基礎(chǔ)培養(yǎng)液、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)時間等因素相關(guān)[17]；(3)獲取的GV期卵母細胞存在一些內(nèi)在缺陷，在體內(nèi)生長過程中受到了一定的抑制。

綜上，IVM技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展了已有20余年，但受體外培養(yǎng)體系和胚胎發(fā)育潛能低等因素的影響，仍處于實驗階段，不能被廣泛地應(yīng)用于臨床。本研究積極探索體外培養(yǎng)體系，通過體外構(gòu)建含顆粒細胞復(fù)合體的共培養(yǎng)體系，提高了促排卵周期中不同來源未成熟卵母細胞的成熟率，改善了MⅠ期卵母細胞成熟后胚胎的發(fā)育潛能；而GV期卵母細胞成熟后的發(fā)育潛能尚不理想。本研究為我們后續(xù)的深入探索提供了方向，同時，我們也觀察到對促排卵周期中獲得的GV期未成熟卵母細胞可能需要在入選標準上做進一步研究，以提高IVM的效率和成果。