長(zhǎng)鏈非編碼RNA DANCR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平和臨床意義

杜金龍

(咸寧市中心醫(yī)院,湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,咸寧 437100)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是惡性程度最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的46%,因其病程短,易復(fù)發(fā),故徹底治療較為困難[1,2]。雖然目前已經(jīng)有手術(shù)切除治療、放療化療、神經(jīng)導(dǎo)航等治療方式,但因瘤體增殖迅速、瘤細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、腫瘤組織有較高的侵襲能力且與正常組織界限不清,故關(guān)于膠質(zhì)瘤的治療效果并不理想[3,4]。腫瘤的病變位置復(fù)雜,病人術(shù)后復(fù)發(fā)率較高,患者預(yù)后較差[5-7]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類(lèi)堿基長(zhǎng)度大于200 bp的RNA,之前被認(rèn)為是RNA轉(zhuǎn)錄中的副產(chǎn)物,不具有生物學(xué)活性[8]。但是近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),在某些腫瘤組織中,一些lncRNA的表達(dá)水平會(huì)出現(xiàn)異常,這些異常表達(dá)的lncRNA可影響細(xì)胞的一些重要的生物學(xué)過(guò)程如轉(zhuǎn)錄、增殖、凋亡以及分化等,這提示這些RNA可能可以作為早期診斷腫瘤的潛在生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)[9-11]。先前的研究證實(shí),lncRNA-DANCR的表達(dá)可能在胃癌[12]、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤[13]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[14]等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是目前,關(guān)于DANCR在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況以及與患者臨床病理特征的相關(guān)性仍無(wú)明確研究結(jié)果。因此本研究通過(guò)檢測(cè)DANCR在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的不同表達(dá)情況,分析其與膠質(zhì)瘤患者各臨床病理特征的相關(guān)程度以及與患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系,明確其臨床意義,探討其作為早期預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)標(biāo)記物的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究統(tǒng)計(jì)了咸寧市中心醫(yī)院自2013-01～2018-01收治的52例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本以及患者的臨床相關(guān)病理資料,入選患者術(shù)前均未接受放化療或者其他抗癌治療,所有病例均為首次手術(shù)治療并且具有連續(xù)5年內(nèi)同步更新的隨訪資料。其中所選病例有男性30例,女性22例,年齡在26-77歲范圍內(nèi),平均年齡為56歲。此外統(tǒng)計(jì)了患者的腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、KPS評(píng)分以及是否發(fā)生復(fù)發(fā)情況。按照WHO(2007年)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)以上腫瘤組織進(jìn)行組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí)8例,Ⅱ級(jí)12例,Ⅲ級(jí)20例,Ⅳ級(jí)12例。此外有23例正常腦組織標(biāo)本取自因顱腦損傷進(jìn)行顱內(nèi)減壓術(shù)的患者。從手術(shù)之日起每3個(gè)月對(duì)該膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行一次預(yù)后隨訪。隨訪方式為入院復(fù)查或者電話(huà)通話(huà)等,患者隨訪資料進(jìn)行同步更新,隨訪截止日期為2018年1月。本研究被咸寧市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)準(zhǔn)許,所有患者術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將收集的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本和正常腦組織標(biāo)本首先進(jìn)行脫蠟處理,接著采用Trizol法提取組織標(biāo)本中的總RNA(Invitrogen,CA,USA),然后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定組織標(biāo)本在波長(zhǎng)為260 nm以及280 nm處的吸光度比值,并計(jì)算OD260/OD280,選擇OD比值在1.8-2.1范圍內(nèi)的總RNA作為樣本。將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后應(yīng)用RT-PCR法分別檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織標(biāo)本中DANCR的表達(dá)水平,內(nèi)參設(shè)置為GAPDH。引物序列如下:DANCR上游引物正向:5′-GCCACTATGTAG-AGGGTTTC-3′;下游引物反向:5′-ACCTGCGCTAAGAACTGAGG-3′。GAPDH上游引物正向:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′;下游引物反向:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。采用2-ΔΔCt法對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析,所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中DANCR表達(dá)水平明顯增高

RT-PCR的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常腦組織相比,神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中DANCR的表達(dá)水平明顯增高(1.00±0.22vs3.06±0.28,P<0.001)。同時(shí)級(jí)別高(Ⅲ-Ⅳ級(jí))的膠質(zhì)瘤患者組織中的DANCR的表達(dá)水平(3.71±0.40)明顯高于級(jí)別低(Ⅰ-Ⅱ級(jí))的膠質(zhì)瘤組織(2.41±0.22),這提示DANCR的表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)(P=0.013,見(jiàn)圖1)。

2.2 DANCR表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

以DANCR在所有膠質(zhì)瘤病理組織樣本中平均表達(dá)水平(3.06±0.28)為界,將入選患者分為DANCR低表達(dá)組(21例,DANCR表達(dá)水平低于平均值)和DANCR高表達(dá)組(31例,DANCR表達(dá)水平高于平均值)。然后分析DANCR的表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性,結(jié)果顯示:神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)水平的DANCR與高病理分級(jí)(P<0.001)、低KPS評(píng)分(P=0.001)以及患者術(shù)后復(fù)發(fā)(P=0.004)有密切關(guān)系,而與患者的年齡(P=0.695)、性別(P=0.947)、腫瘤大小(P=0.523)以及腫瘤數(shù)目(P=0.463)等均無(wú)關(guān)(見(jiàn)表1)。

2.3 DANCR的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的關(guān)系

用Kaplan-Meier繪制DANCR低表達(dá)組和高表達(dá)組的患者術(shù)后5年生存率曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn),結(jié)果顯示,神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中DANCR高表達(dá)組的患者預(yù)后和低表達(dá)組相比明顯較差,患者術(shù)后5年生存期大大縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012,見(jiàn)圖2)。

與正常腦組織比較,***P<0.001 與Ⅰ-Ⅱ級(jí)比較，**P<0.01 A.神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中DANCR的表達(dá) B.不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者組織中的DANCR的表達(dá)圖1 LncRNA-DANCR在正常腦組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of lncRNA-DANCR in normal brain tissues and glioma tissues

表1lncRNA-DANCR表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性

Table1CorrelationbetweenlncRNA-DANCRexpressionlevelsandclinicopathologicalcharacteristicsofgliomapatients

臨床特征分層亞組nDANCR低表達(dá)(n=21)DANCR高表達(dá)(n=31)χ2P年齡0.1540.695 <50歲281216 ≥50歲24915性別0.0040.947 男301218 女22913病理分級(jí)21.185<0.001 Ⅰ-Ⅱ級(jí)20164 Ⅲ-Ⅳ級(jí)32527KPS評(píng)分10.5640.002 ≥80分23158 <80分29623術(shù)后復(fù)發(fā)8.1790.008 是32824 否20137腫瘤直徑0.4070.523 <4 cm221012 ≥4 cm301119腫瘤個(gè)數(shù)0.5380.573 單個(gè)291316 多個(gè)23815

圖2 lncRNA-DANCR高表達(dá)組和低表達(dá)組患者術(shù)后生存率的比較Figure 2 Comparison of postoperative survival rates of patients between lncRNA-DANCR high-expression group and low-expression group

表2膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理因素與生存率的單因素分析結(jié)果

Table2Univariateanalysisofdifferentclinicopathologicalfactorsandsurvivalratesingliomapatients

臨床病理特征HR(95% CI)P年齡(<50歲 vs ≥50歲)1.231(0.694-2.146)0.405性別(男vs女)1.092(0.601-1.857)0.572KPS評(píng)分(<80 vs ≥80)2.105(1.241-3.922)0.019病理分級(jí)(Ⅰ-Ⅱ級(jí)vsⅢ-Ⅳ級(jí))1.984(1.187-3.568)0.022術(shù)后復(fù)發(fā)(是vs否)2.463(1.445-4.525)0.010腫瘤大小(<4 cm vs ≥4 cm)1.484(0.804-2.627)0.283腫瘤數(shù)目(單個(gè)vs多個(gè))1.129(0.646-1.921)0.502DANCR表達(dá)水平(低vs高)2.734(1.526-5.171)0.002

將各患者臨床病理指標(biāo)與生存率進(jìn)行了單因素分析,結(jié)果見(jiàn)表2。而后將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的病理指標(biāo)進(jìn)行多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。分析結(jié)果顯示:高表達(dá)水平的DANCR、高病理級(jí)別、KPS評(píng)分<80分以及術(shù)后復(fù)發(fā)均為影響膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(見(jiàn)表3)。

表3膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理因素與生存率的多因素分析結(jié)果

Table3MultivariateCoxregressionanalysisofdifferentclinicopathologicalfactorsandsurvivalratesingliomapatients

臨床病理特征HR(95% CI)PKPS評(píng)分(<80 vs ≥80)2.421(1.417-4.439)0.011病理分級(jí)(Ⅰ-Ⅱ級(jí)vsⅢ-Ⅳ級(jí))2.259(1.384-4.151)0.017術(shù)后復(fù)發(fā)(是vs否)2.815(1.762-5.322)0.001DANCR表達(dá)水平(低vs高)2.982(1.829-5.507)<0.001

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的惡性程度最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤,具有極強(qiáng)的侵襲性和無(wú)限增殖的特點(diǎn),并且在組織中呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。與正常組織之間的界限不清楚使得手術(shù)中很難將其完全切除,繼而殘留的腫瘤細(xì)胞會(huì)再次增殖,導(dǎo)致患者術(shù)后極易復(fù)發(fā),臨床預(yù)后較差[15]。目前,在有關(guān)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床診療中仍然缺少可靠的可預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。雖然大量的研究已經(jīng)證實(shí)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后與WHO分級(jí)、KPS評(píng)分等因素有關(guān),但是由于患者自身的差異性和腫瘤的復(fù)雜性,這些因素并不能達(dá)到精確評(píng)估的要求[16,17]。因此本課題組進(jìn)行了一系列相關(guān)研究,目的在于尋找一種可提前診斷膠質(zhì)瘤并且可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物,從而為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷、臨床治療以及判斷預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)證實(shí)和新手段。

近些年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),在某些腫瘤組織中,lncRNA的表達(dá)水平會(huì)出現(xiàn)異常,而這些異常表達(dá)的lncRNA可影響腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過(guò)程中多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。同時(shí)有研究證實(shí),lncRNA與細(xì)胞生物學(xué)特征密切相關(guān),可通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞癌變并影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力等,這提示其可能作為腫瘤發(fā)生潛在的生物學(xué)標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)[19]。例如,Zhao等[20]的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-HOTAIR在乳腺癌中作為促癌基因,其表達(dá)水平在乳腺癌組織和細(xì)胞中顯著升高,抑制癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-HOTAIR的表達(dá),可通過(guò)調(diào)節(jié)microRNA-20a-5p/HMGA2通路,明顯抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Yang等[21]證實(shí)lncRNA-MAGI2-AS3在乳腺癌中作為抑癌基因,其表達(dá)水平在乳腺癌組織中顯著降低,可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。DANCR(differentiation antagonizing non-coding RNA,反分化長(zhǎng)鏈非編碼RNA)作為lncRNA家族中的一員,已被證實(shí)在多種類(lèi)型的惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。例如,有研究報(bào)道,DANCR在非小細(xì)胞性肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高,DANCR可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[22]。也有研究證實(shí)其在膠質(zhì)瘤中的調(diào)節(jié)作用,Li等[23]證實(shí),DANCR在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平呈異常升高趨勢(shì),過(guò)表達(dá)的DANCR可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。然而,DANCR在預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的作用卻沒(méi)有研究報(bào)道。因此,本研究探討了不同表達(dá)水平的DANCR與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征以及預(yù)后之間的相關(guān)性。

在研究中,我們首先應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了DANCR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá)水平,分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中DANCR的表達(dá)水平明顯低于正常腦組織,且表達(dá)量隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而增高。然后,我們進(jìn)一步分析了DANCR的表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者各臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性,結(jié)果顯示:神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)水平的DANCR與腫瘤的高病理分級(jí)、低KPS評(píng)分以及患者術(shù)后復(fù)發(fā)有密切關(guān)系,而與患者的年齡、性別、腫瘤大小以及腫瘤數(shù)目等均無(wú)關(guān)。最后,我們探討了DANCR的表達(dá)水平以及病理分級(jí)、KPS評(píng)分等因素與膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的關(guān)系。根據(jù)我們同步更新的隨訪數(shù)據(jù)可知,DANCR高表達(dá)組患者的術(shù)后5年生存率明顯低于DANCR低表達(dá)組。同時(shí)我們的研究證實(shí)高表達(dá)水平的DANCR、高病理級(jí)別、KPS評(píng)分<80分以及術(shù)后復(fù)發(fā)均與膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后情況密切相關(guān),都可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述,本研究中我們證實(shí)了DANCR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著增高,而高表達(dá)水平的DANCR與膠質(zhì)瘤患者的不良臨床預(yù)后有關(guān),可作為預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立因素。然而DANCR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制,以及可能涉及到的更多靶基因和信號(hào)傳導(dǎo)通路目前尚不能得出結(jié)論,這將是我們團(tuán)隊(duì)下一步的研究方向和重點(diǎn)。