微小RNA-3680-3p在腎癌組織中的表達及對人腎癌細胞ACHN遷移和增殖的影響

王 斌,李 建,何 軒,耿明英,金 豐,王 閣,王 東,宋 揚

(陸軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:songyang84zhu@163.com)

腎癌是泌尿系統(tǒng)第二常見的惡性腫瘤,發(fā)病率僅次于膀胱癌[1]。腎癌的早期轉移導致很多患者的預后并不理想。研究腎癌發(fā)生發(fā)展的機制和有效的分子靶向治療,是腎癌臨床治療亟待解決的難題。微小RNA(miRNA)是一種人體內源性小分子單鏈RNA,長19-25個核苷酸,主要在轉錄后水平發(fā)揮基因調節(jié)作用[2]。miRNA通過與基因mRNA的3′非編碼區(qū)結合,誘導靶基因mRNA的降解或者直接抑制其翻譯[3]。越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)與腎癌的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為密切相關,miRNA在腎癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究已成為腎癌研究領域的重要方向[4]。miR-3680-3p是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA,其在疾病特別是腫瘤中的作用少有報道。本研究旨在通過生物信息學技術探究miR-3680-3p在腎癌細胞中的作用機制,并觀察miR-3680-3p對腎癌細胞遷移和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源

16例腎癌及癌旁組織標本來自陸軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心,為泌尿外科住院治療的患者經手術切除的標本,本研究經陸軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批注,患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株及主要試劑

人腎癌細胞株ACHN購于上海信然生物技術有限公司。野生型與突變型VEGF-C 3′非翻譯區(qū)熒光素酶報告基因質粒(pGL-4載體)由南京諾唯贊生物科技有限公司設計并合成;雙熒光素酶報告基因檢測實驗試劑盒購于美國Promega公司;實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;攜帶miR-3680-3p的慢病毒、陰性對照慢病毒、miR-3680-3p模擬物和miR-NC購于上海吉瑪公司;Transwell小室購于美國Corning公司;噻唑藍(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司;一抗VEGF-C、N-cadherin、Zeb-2、CDK4、Cyclin A1和GAPDH購于美國Abcam公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和感染

人腎癌細胞株ACHN用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的ACHN細胞接種于24孔板,待細胞匯合度達到50%時,按照慢病毒感染說明書進行感染,分別感染陰性對照慢病毒和攜帶miR-3680-3p的慢病毒,分為對照組和實驗組。感染后第24小時觀察ACHN細胞狀態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 qPCR檢測miR-3680-3p和VEGF-C的表達水平

按照Trizol法提取組織或細胞中總RNA并逆轉錄為cDNA。以U6或GAPDH作參照,分別應用miR-3680-3p和VEGF-C引物通過qPCR試劑盒擴增檢測miR-3680-3p和VEGF-C的表達水平。U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miR-3680-3p上游引物:5′-GGTTTTGCATGACCCTGGG-3′,下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;VEGF-C上游引物:5′-GGCTGGCAACATAACAGAGAA-3′,下游引物5′-CCCCACATCTATACACACCTCC-3′;GAPDH上游引物:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。qPCR反應條件:95 ℃預變性8 min,95 ℃變性8 s,63 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,反應40個循環(huán)。數(shù)據(jù)結果應用2-ΔΔCt方法分析。

1.5 生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-3680-3p的靶基因

結合生物信息學預測軟件DIANA TOOLS、TargetScan及miRWalk預測miR-3680-3p的靶基因。野生型VEGF-C 3′非翻譯區(qū)質粒命名為VEGF-C 3′ UTR-WT,突變型VEGF-C 3′非翻譯區(qū)質粒命名為VEGF-C 3′ UTR-MUT。將對數(shù)生長期的ACHN細胞接種至6孔板,待細胞匯合度達50%,將miR-NC或miR-3680-3p模擬物分別與VEGF-C 3′ UTR-WT或VEGF-C 3′ UTR-MUT質粒,采用Lipofectamine?3000共轉染至ACHN細胞。應用雙熒光素酶報告基因檢測實驗試劑盒檢測各組ACHN細胞的熒光,以螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性的比值代表各組ACHN細胞的相對熒光素酶活性。

1.6 Western blot檢測靶基因的表達

胰酶消化收集兩組細胞,采用蛋白裂解液裂解細胞并提取總蛋白。每組上樣40 μg蛋白樣品至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠,電泳后電轉至PVDF膜。封閉液封閉后,在4 ℃下分別孵育VEGF-C、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)并過夜。在室溫下孵育相應的二抗后,滴加超敏ECL發(fā)光試劑顯影,采用凝膠成像儀拍照。

1.7 Transwell實驗檢測ACHN細胞的遷移能力

胰酶消化收集兩組細胞,采用無血清DMEM培養(yǎng)基調整細胞密度為2×105個/ml。Transwell小室內加入200 μl細胞懸液,Transwell小室外加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內培養(yǎng)第24小時,采用甲醇在室溫下固定15 min,采用結晶紫染液在室溫染色15 min,采用流水沖洗,棉簽擦去未穿過底膜的細胞后晾干。顯微鏡下隨機選取4個視野計算穿膜ACHN細胞數(shù),取平均數(shù)。

1.8 MTT法檢測ACHN細胞的增殖能力

胰酶消化收集兩組細胞,調整細胞密度,以4 000個/孔接種至96孔板,每孔加入200 μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)第1,2,3,4,5天,每孔分別加入5 mg/ml的MTT試劑20 μl,培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入200 μl二甲基亞砜,搖床振蕩至結晶溶解,使用酶標儀檢測各孔在波長495 nm處的吸光度(A)值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 腎癌組織中miR-3680-3p的表達

qPCR檢測結果顯示,腎癌組織和癌旁組織中miR-3680-3p的表達量分別為1.58±0.15和3.44±0.11,癌旁組織miR-3680-3p的表達量為腎癌組織的2.18倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=9.83,P<0.01,見圖1)。

與癌旁組織比較,**P<0.01圖1 腎癌組織中miR-3680-3p的表達量Figure 1 Expression of miR-3680-3p in renal cell carcinoma

2.2 ACHN細胞感染miR-3680-3p病毒的效率

qPCR檢測結果顯示,對照組和實驗組細胞中miR-3680-3p的表達量分別為1.04±0.16和8.33±0.56,實驗組miR-3680-3p的表達量為對照組的8.00倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=12.59,P<0.01,見圖2)。

2.3 生物信息學預測結果

結合生物信息學預測軟件DIANA TOOLS、TargetScan及miRWalk的分析預測miR-3680-3p的靶基因是VEGF-C,具體的結合序列見圖3。

與對照組比較,**P<0.01圖2 對照組和實驗組ACHN細胞中miR-3680-3p的表達量Figure 2 Expression of miR-3680-3p in ACHN cells in control group and experimental group

圖3 miR-3680-3p與VEGF-C 3′-UTR互補結合的序列Figure 3 Sequence of miR-3680-3p complementary to VEGF-C 3′-UTR

2.4 miR-3680-3p與VEGF-C的靶向結合驗證結果

圖3結果顯示,與VEGF-C 3′ UTR-WT相比,VEGF-C 3′ UTR-MUT由序列“UGCAAAA”突變?yōu)椤癆CGUUUU”。分別將miR-NC或miR-3680-3p模擬物與VEGF-C 3′ UTR-WT或VEGF-C 3′ UTR-MUT質粒轉染至ACHN細胞中,雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測相對熒光素酶活性,以驗證miR-3680-3p與VEGF-C的靶向結合。圖4結果顯示,miR-3680-3p可顯著減弱VEGF-C 3′ UTR-WT質粒轉染細胞的相對熒光素酶活性,而對VEGF-C 3′ UTR-MUT質粒轉染ACHN細胞的相對熒光素酶活性無作用,顯示miR-3680-3p可直接結合VEGF-C基因。

2.5 ACHN細胞轉染miR-3680-3p對VEGF-C mRNA表達的影響

qPCR檢測結果顯示,轉染后實驗組ACHN細胞中VEGF-C mRNA的表達量明顯低于對照組(0.19±0.05vs1.00±0.06),差異有統(tǒng)計學意義(t=9.79,P<0.01)。

2.6 VEGF-C蛋白的表達水平

為進一步探討miR-3680-3p在ACHN細胞中的作用機制,采用Western blot檢測轉染miR-3680-3p模擬物48 h后VEGF-C蛋白、細胞遷移相關蛋白、細胞增殖相關蛋白表達情況。結果顯示,與對照組相比,實驗組VEGF-C表達水平降低,細胞遷移相關蛋白N-cadherin和Zeb-2蛋白表達明顯減少,細胞增殖相關蛋白CDK4、Cyclin A1表達減少(見圖5)。

1.miR-3680-3p+VEGF-C 3′UTR-MUT;2.miR-3680-3p+VEGF-C 3′UTR-WT;3.miR-NC+VEGF-C 3′UTR-MUT;4.miR-NC+VEGF-C 3′UTR-WT;與第1組(miR-3680-3p+VEGF-C 3′UTR-MUT)相比,**P<0.01圖4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-3680-3p與VEGF-C的靶向結合驗證Figure 4 Verification of the binding of miR-3680-3p to VEGF-C by dual luciferase reporter assay

圖5 miR-3680-3p對VEGF-C蛋白及相關蛋白表達的影響Figure 5 Effect of miR-3680-3p on the expression of VEGF-C protein and related proteins

2.7 miR-3680-3p對ACHN細胞遷移能力的影響

如圖6所示,對照組和實驗組細胞中穿膜細胞數(shù)分別為(166.90±22.81)個和(51.43±11.57)個。與對照組比較,實驗組穿膜細胞數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=4.52,P<0.01),miR-3680-3p一定程度上抑制腎癌細胞ACHN的遷移。

2.8 miR-3680-3p對ACHN細胞增殖能力的影響

MTT檢測結果顯示,實驗組ACHN細胞在感染后第1,2天的A值差異無統(tǒng)計學意義(t=0.11,P>0.05;t=2.64,P>0.05);在第3,4,5天的A值低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(t=3.50,P<0.05;t=3.58,P<0.05;t=4.23,P<0.05，見圖7)。表明miR-3680-3p一定程度上抑制腎癌細胞ACHN的增殖能力。

與對照組相比,**P<0.01圖6 miR-3680-3p對ACHN細胞遷移能力的影響Figure 6 Effect of miR-3680-3p on the migration ability of ACHN cells

與對照組比較,*P<0.05圖7 miR-3680-3p對ACHN細胞增殖能力的影響Figure 7 Effect of miR-3680-3p on the proliferation of ACHN cells

3 討論

腎癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一,腎癌的發(fā)病率逐年升高[5]。近年來的研究表明,miRNA廣泛參與調控腎癌的的發(fā)生、發(fā)展。如miR-200a、miR-30a-5p、miR-210-3p[6-8]在腎癌中表達顯著下調,具有抑制腎癌細胞生長或轉移的作用。如miR-21、miR-144-3p、miR-373、miR-720等[9-12]miRNA在腎癌中表達明顯上調,具有促進腎癌細胞增殖或轉移的作用。miR-3680-3p是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA,關于miR-3680-3p的研究報道很少。miR-3680-3p在腎癌中表達及對其發(fā)生發(fā)展的調控作用尚不明確。

本研究結果顯示,miR-3680-3p在腎癌組織中的表達明顯少于癌旁組織,表明miR-3680-3p在腎癌中的表達異常,miR-3680-3p可能在腎癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用。為了研究miR-3680-3p對腎癌惡性生物學的影響,本研究通過慢病毒感染在腎癌細胞ACHN中過表達miR-3680-3p,利用Transwell和MTT法觀察ACHN細胞的遷移和增殖變化。與對照組相比,miR-3680-3p可明顯抑制腎癌細胞ACHN的遷移和增殖,miR-3680-3p在腎癌的生長和轉移中發(fā)揮重要作用。

本研究通過生物信息學預測軟件DIANA TOOLS、TargetScan及miRWalk分析表明,血管細胞生長因子C(VEGF-C)是miR-3680-3p的靶基因。VEGF-C屬于VEGF家族成員,最初在前列腺癌中被發(fā)現(xiàn),主要作為一種可刺激血管細胞生長因子受體3磷酸化的細胞因子[13]。已有研究發(fā)現(xiàn),VEGF-C可通過活化增殖與轉移信號分析,促進腫瘤細胞的增殖和轉移,發(fā)揮明顯的癌基因作用[14]。VEGF-C已被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌、膀胱癌、結腸癌等[15-17]多種腫瘤中表達明顯升高,與患者的不良預后密切相關。有研究表明,VEGF-C在腎癌中的表達明顯升高,VEGF-C與腎癌的惡性生物學行為密切相關,VEGF-C可能作為腎癌的治療靶點。本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗結果顯示,miR-3680-3p可直接結合VEGF-C mRNA的3′ UTR區(qū)域;qPCR和Western blot表明,miR-3680-3p過表達可在mRNA和蛋白水平上抑制VEGF-C的表達。本研究結果顯示,VEGF-C蛋白表達降低后,細胞遷移相關蛋白N-cadherin和Zeb-2蛋白表達明顯減少,提示細胞遷移能力下降。細胞增殖相關蛋白CDK4、Cyclin A1表達減少,提示細胞增殖能力受到顯著抑制。miR-3680-3p可能通過降低VEGF-C基因的表達,抑制腎癌細胞的遷移和增殖能力。

綜上所述,本研究結果表明miR-3680-3p參與調控腎癌的發(fā)生發(fā)展,miR-3680-3p與VEGF-C存在直接的靶向作用關系。miR-3680-3p可通過降低VEGF-C基因的表達,抑制腎癌細胞ACHN的遷移和增殖能力。miR-3680-3p有望成為新的腎癌分子治療靶點。