Rev-erb激動劑GSK4112對心肌梗死大鼠心肌損傷和心臟重塑的影響

周中淑,傅春江,鄒 雪,唐 黎

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:chunjiang510@sina.com)

心肌梗死是心血管疾病致死率最高的疾病之一[1]。心肌梗死是由于冠狀動脈狹窄或痙攣,導(dǎo)致心肌急性或持續(xù)性缺血缺氧,心肌細(xì)胞死亡。心肌梗死后,即使冠脈再通,心肌細(xì)胞數(shù)目亦減少,影響心臟的射血功能[2]。白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種促炎癥細(xì)胞因子均參與心肌重塑[3]。Rev-erb為核受體家族的成員,研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)生物機(jī)體組織代謝的作用。Rev-erb家族的蛋白C端缺乏能和配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[4],但是可以通過招募核受體阻抑因子和組蛋白去乙?；?等來抑制Rev-erb蛋白的表達(dá)。組蛋白去乙?；?是一種Rev-erb激動劑,是小分子化學(xué)探針[5]。黃國棟[6]研究發(fā)現(xiàn)Rev-erba和per1b對斑馬魚自噬基因的節(jié)律性具有重要的調(diào)控作用。Fontaine等[7]首先報道了Rev-erb和炎癥之間具有相關(guān)性,Rev-erb能抑制Tlr4的表達(dá),從而控制炎癥信號。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在人類巨噬細(xì)胞中,用藥理學(xué)方法增加Rev-erb的mRNA表達(dá)量后直接導(dǎo)致促炎癥因子白細(xì)胞介素6的mRNA表達(dá)量下降[8-10]。本研究擬采用Rev-erb激動劑GSK4112處理心肌梗死大鼠,觀察其對大鼠的心肌損傷和心臟重塑的影響,并探討作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10周齡雄性SPF級Wistar大鼠48只(第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心 生產(chǎn)許可證號:270M2),體質(zhì)量(300±40)g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d(從購買時算起),隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(n=11)、假手術(shù)給藥組(n=13)、實驗對照組(n=12)和實驗給藥組(n=12)。假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組大鼠全部存活。實驗對照組和實驗給藥組在結(jié)扎左冠狀動脈前降支后分別有3只和2只大鼠死亡。

1.2 心肌梗死造模方法

兩組大鼠均采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,沿左側(cè)肋間切開胸廓。實驗組,應(yīng)用冠狀動脈結(jié)扎建立心肌梗死模型[11]。假手術(shù)組僅切開胸廓和心包,不做結(jié)扎。模型建立成功后,飼養(yǎng)7 d后。實驗組隨機(jī)分為實驗給藥組和實驗對照組,假手術(shù)組隨機(jī)分為假手術(shù)給藥組和假手術(shù)對照組;實驗給藥組和假手術(shù)給藥組連續(xù)每日2次皮下注射REV-ERB激動劑GSK4112(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)100 μg/kg,實驗對照組和假手術(shù)對照組同時注射相同量的生理鹽水。冠狀動脈結(jié)扎是最常選用的大鼠心肌梗死造模方法,其具體操作步驟為:將大鼠用氯氨酮麻醉后接上小動物呼吸機(jī),經(jīng)左側(cè)第4肋間剪開皮膚,鈍性分離肌肉組織,打開胸腔并剪開心包膜,擠壓出心臟,在左心耳與肺動脈圓錐之間穿線,結(jié)扎左冠狀動脈前降支(于分支的起點處約1-2 mm),用Ⅱ?qū)碛涗泝x記錄心電圖。

1.3 心肌梗死面積和梗死壁厚度的檢測

在造模后2 h取標(biāo)本,采用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉四組大鼠,然后取出心臟,分離心房及右心室。采用10%甲醇溶液固定后,石蠟切片(厚度5 μm),馬松三色染色。從每個心臟的切片中隨機(jī)選取三張,測量梗死面積和梗死壁厚度。其中心臟梗死面積的計算采用梗死壁的表面積占整個LV表面積比值進(jìn)行表征。梗死壁的厚度即為梗死最薄區(qū)域厚度。

1.4 采用TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡

采用TUNEL染色陽性率表征心肌細(xì)胞凋亡情況,測定方法參照TUNEL試劑盒操作說明進(jìn)行[12],凋亡心肌細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈綠色。每個心臟中隨機(jī)選取10張組織切片,隨機(jī)選取每張切片中的5個視野,觀察記錄TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。按照下列公式計算得到心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)(%):

凋亡指數(shù)(%)=(心肌細(xì)胞核TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)心肌細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.5 采用血管新生標(biāo)志物CD31檢測梗死邊緣區(qū)血管新生情況

將隨機(jī)選取10張心肌梗死組織切片,放入載玻片干燥后脫蠟[13]。采用40×EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)后,用3%BSA封閉。然后采用1 ∶100稀釋的CD31抗體孵育過夜。PBS緩沖液漂洗后,以1 ∶200稀釋Cy3熒光抗體孵育1 h后漂洗3次。熒光封片劑封片后,顯微鏡觀察5個視野并記錄CD31陽性數(shù)目。

1.6 心臟重塑指標(biāo)檢測

測定左室短長軸之比(D/L),左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd),室間隔厚度(IVST),左室后壁厚度(LVPWT),從而按照下列公式計算得到左室心肌質(zhì)量(LVM)及其指數(shù)(LVMI)[14]:

LVM(g)=1.04×[(LVEDd+LVPWT+IVST)3-LVEDd3]-13.6;

LVMI=(g/m2)=LVM/體表面積(BSA)。

1.7 檢測心臟血清中IL-1β、IL-6和TNF-α三項炎癥因子水平

血清IL-1β的檢測采用雙抗體放免法檢測,血清IL-6的檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測,血清TNF-α的檢測采用雙抗體夾心ELISA法檢測。檢測均按照試劑盒檢測方法進(jìn)行,試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組在解剖后，均未發(fā)現(xiàn)心肌梗死現(xiàn)象(見圖1)。實驗對照組心肌梗死位置為前間壁，梗死面積為(51.32±2.40)%；而實驗給藥組心肌梗死位置為前間壁，梗死面積為(43.96±1.75)%，低于實驗對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明REV-ERB激動劑GSK4112能夠降低心肌梗死大鼠的心肌梗死面積。

圖1 大鼠心肌梗死面積Masson染色圖Figure 1 Masson staining of myocardial infarction area in rats with different treatments

2.2 心室壁梗死厚度的檢測

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組在解剖后，均未發(fā)現(xiàn)心肌梗死現(xiàn)象，因此并無梗死壁。實驗對照組心肌梗死壁厚度為(0.38±0.01)mm；而實驗給藥組心肌梗死壁厚度為(0.54±0.02)mm，高于實驗對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明REV-ERB激動劑GSK4112能夠增加心肌梗死大鼠的心肌梗死壁厚度。

2.3 室間壁心肌細(xì)胞凋亡情況

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組大鼠心肌細(xì)胞只有少量細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為(0.79±0.08)%和(0.81±0.06)%，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗對照組和實驗給藥組的心肌細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組，說明模型建立成功。實驗對照組心肌細(xì)胞凋亡率高達(dá)(6.02±0.57)%；而實驗給藥組細(xì)胞凋亡率降低為(3.79±0.21)%，低于實驗對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明REV-ERB激動劑GSK4112能夠降低心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率。

圖2 大鼠的心肌細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞結(jié)果Figure 2 Apoptotic rate of cardiac myocytes in rats by flow cytometry

2.4 梗死邊緣區(qū)血管新生情況

為了明確Rev-erb激動劑GSK4112能否通過促血管新生改善心肌梗死后對心臟缺血性損傷和心臟重塑，采用新生血管標(biāo)志物CD31反映血管新生情況，并進(jìn)行定量分析。假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組大鼠并未發(fā)生心肌梗死和心肌損傷，因此并未發(fā)現(xiàn)血管新生情況。實驗對照組心肌梗死邊緣區(qū)血管密度為31.65±2.38，實驗給藥組心肌梗死邊緣區(qū)血管密度為48.96±3.55，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明Rev-erb激動劑GSK4112在大鼠機(jī)體內(nèi)具有成血管功能，因此能夠改善心肌梗死后心肌缺血損傷。

2.5 心臟重塑指標(biāo)

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組的左室短長軸之比(D/L)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、室間隔厚度(IVST)、左室后壁厚度(LVPWT)、左室心肌質(zhì)量(LVM)及其指數(shù)(LVMI)間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。實驗對照組的D/L、LVEDd、LVPWT、LVM和LVMI均高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05，見表1)。實驗各組IVST與假手術(shù)各組均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。實驗給藥組的D/L、LVEDd、LVPWT、LVM和LVMI均低于實驗對照組(P<0.05，見表1)。而實驗給藥組的D/L、LVEDd和LVM均高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05)，LVPWT和LVMI則恢復(fù)至假手術(shù)組大鼠水平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。以上結(jié)果說明Rev-erb激動劑GSK4112能夠顯著改善心肌梗死大鼠的心臟重塑指標(biāo)，阻止心肌重塑。

2.6 炎癥因子水平

假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗對照組炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05,見表2)。相對于實驗對照組,實驗給藥組炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平均減低(P<0.05),但仍高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05,見表2)。說明REV-ERB激動劑GSK4112可抑制心肌梗死后的炎癥反應(yīng)。

分組D/LLVEDd(cm)IVST(cm)LVPWT(cm)LVW(g)LVMI(g/m2)假手術(shù)對照組0.45±0.094.15±0.280.93±0.061.04±0.08176.4±19.593.5±9.2假手術(shù)給藥組0.48±0.094.08±0.300.98±0.051.11±0.17169.2±15.894.1±8.9實驗對照組 0.79±0.09?6.83±0.52?0.94±0.071.48±0.13?325.3±20.5? 168.5±8.8?實驗給藥組 0.61±0.05?#5.21±0.35?#0.97±0.091.16±0.10?229.1±10.3?# 109.3±10.5?

與假手術(shù)對照組比較,*P<0.05;與實驗對照組比較,#P<0.05

分組 IL-1β IL-6TNF-α 假手術(shù)對照組11.7±0.9109.3±9.112.4±1.1假手術(shù)給藥組10.6±0.9112.7±8.911.2±0.8實驗對照組 19.5±1.2?312.9±10.2?32.9±2.2?實驗給藥組 13.7±1.1?#205.6±9.4?#23.6±1.7?#

與假手術(shù)對照組比較,*P<0.05;與實驗對照組比較,#P<0.05

3 討論

近現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體發(fā)生心肌梗死后會出現(xiàn)心肌功能喪失,進(jìn)而導(dǎo)致存活的心肌缺血,因此心肌梗死會逐漸延伸,心肌功能下降[15],出現(xiàn)心臟重塑。研究證實,心臟重塑機(jī)會越多,心肌梗死后患者存活率越低[16]。因此阻止心肌梗死后的心臟重塑,對于提高患者的生存率具有極其重要的意義。心肌梗死后,大量的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集浸潤造成的炎癥會阻塞血管并釋放氧自由基,造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷,從而導(dǎo)致心肌缺血損傷和缺血再灌注損傷[17]。此時腫瘤壞死因子TNF-α的mRNA過度表達(dá),血清中TNF-α含量上升,引發(fā)機(jī)體心肌細(xì)胞的凋亡[18]。高度表達(dá)的白介素(IL)會通過改變血管內(nèi)皮細(xì)胞表型,造成炎性細(xì)胞傾向于滲透至血管外。此時活化的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以通過誘導(dǎo)TNF-α和IL等炎癥因子的表達(dá),造成心肌炎癥損傷。因此,若能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化,降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平,有助于改善心肌缺血性損傷[19,20]。

本研究顯示,模型建立后假手術(shù)對照組11只大鼠在術(shù)后全部存活,假手術(shù)給藥組也全部存活。實驗對照組和實驗給藥組在結(jié)扎左冠狀動脈前降支后分別有3只和2只死亡。假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組在解剖后,均未無心肌梗死現(xiàn)象。而實驗給藥組心肌梗死面積、細(xì)胞凋亡率、D/L、LVEDd、LVPWT、LVM、LVMI和炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于實驗對照組(P<0.05),高于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05)。實驗給藥組心肌梗死壁厚度和心肌梗死邊緣區(qū)血管密度均高于實驗對照組(P<0.05),低于假手術(shù)對照組和假手術(shù)給藥組(P<0.05)。該結(jié)果說明Rev-erb激動劑GSK4112能夠抑制心肌梗死后大鼠機(jī)體內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA的表達(dá),降低炎癥因子含量,從而降低心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率。另外Rev-erb激動劑GSK4112在大鼠機(jī)體內(nèi)具有成血管功能。從而降低心肌梗死大鼠的心肌梗死面積、增加心肌梗死大鼠的心肌梗死壁厚度、改善心肌梗死后心肌缺血損傷、阻止心肌重塑。

綜上所述,Rev-erb激動劑能夠通過降低炎癥因子的含量產(chǎn)生抗炎作用,進(jìn)而改善心肌梗死后的心肌缺血性損傷和抑制心臟重塑。