紫蘇葉黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

(金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江 金華 321000)

油脂中的不飽和脂肪酸在氧、日光、微生物、酶等作用下會(huì)被氧化而酸敗變質(zhì)[1]。在氧化過程中會(huì)產(chǎn)生自由基、氫過氧化物及醛和酮等化合物，使油脂本身的營養(yǎng)成分遭到破壞從而喪失營養(yǎng)價(jià)值[2-3]。除了采用低溫避光、油脂精煉等方法延緩油脂及含油食品氧化酸敗，添加抗氧化劑是防止和延緩油脂氧化劣變的最行之有效的方法[4]。傳統(tǒng)的抗氧化劑包括TBHQ，BHA，BHT和PG等，都是合成抗氧化劑[5]。實(shí)驗(yàn)表明：合成抗氧化劑對(duì)動(dòng)物體有危害，如BHA對(duì)白鼠有致癌作用、BHT可引起動(dòng)物肝臟增大，現(xiàn)已限制或停止使用[6]。天然抗氧化劑由于高效無毒、安全性高，已成為食品添加劑研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，也是食品科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)發(fā)展趨勢[7]。

紫蘇(PerillafrutescensL.)，唇形科紫蘇屬，一年生草本植物，具有特異芳香氣味[8]，含有多種活性成分[9]，是我國首批公布的藥食兩用中草藥資源之一。紫蘇葉含有的黃酮類物質(zhì)是一類多功能的天然活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)血脂和提高免疫力等功能，在抗癌和抗衰老方面能起到重要作用[10]。目前國內(nèi)對(duì)紫蘇葉的研究主要集中在紫蘇葉黃酮提取、降血糖和抗炎等方面[11]，對(duì)紫蘇葉黃酮在油脂中抗氧化的研究報(bào)道較少。筆者通過微波輔助提取紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以大豆油為研究對(duì)象，考察紫蘇葉黃酮對(duì)高溫下油脂的抗氧化作用，為深入研究和開發(fā)紫蘇的價(jià)值及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇葉，浙江江山世紫生物科技公司；AR1140電子分析天平，奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市江南儀器廠；R206B可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；722E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮含量測定

以蘆丁為標(biāo)樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定紫蘇提取物中總黃酮含量[12]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為

y=0.951 8x+0.031 1

式中：y為吸光度；x為蘆丁質(zhì)量濃度，單位為mg/mL；相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 6。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

取20 g干燥紫蘇葉(粉碎過100目篩)，按照一定的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，然后設(shè)定微波功率和提取時(shí)間，提取完成后，離心10 min，測定上清液中黃酮含量。

以黃酮提取量為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。1) 考察微波功率的影響，料液比為m(紫蘇葉)∶V(乙醇)=1∶12 g/mL，微波功率分別設(shè)置為200，300，400，500，600 W，提取時(shí)間為30 min；2) 考察料液比的影響，料液比m(紫蘇葉)∶V(乙醇)分別為1∶8，1∶10，1∶12，1∶14，1∶1，1∶16 g/mL，微波功率為300 W，提取時(shí)間為30 min；3) 考察提取時(shí)間的影響，料液比為m(紫蘇葉)∶V(乙醇)=1∶12 g/mL，微波功率為300 W，提取時(shí)間分別為20，25，30，35，40 min。

1.2.3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇微波功率、料液比m(紫蘇葉)∶V(乙醇)和提取時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，以黃酮提取量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.5軟件對(duì)紫蘇葉中黃酮微波提取工藝參數(shù)進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.4 紫蘇葉黃酮對(duì)高溫下大豆油品質(zhì)的影響

由于紫蘇葉黃酮較難溶于油脂，需添加助溶劑以增加其在油脂中的溶解度，選擇聚乙二醇作為助溶劑。稱取0.5 g紫蘇葉黃酮，加入聚乙二醇5 mL，混勻，加入大豆油中，在燒杯中配置紫蘇葉黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0，0.1%，0.3%和0.5%的大豆油各50 g，置于180 ℃(模擬食用油煎炸溫度)的烘箱正中央，每隔一定時(shí)間測定油樣的酸價(jià)、過氧化值、p-茴香胺值和維生素E含量，計(jì)算全氧化值，進(jìn)而衡量高溫下紫蘇葉黃酮對(duì)大豆油的抗氧化性。

大豆油酸價(jià)和過氧化值參照GB/T 5538—2005進(jìn)行測定，p-茴香胺值按GB/T 24304—2009進(jìn)行測定。全氧化值(TV)是評(píng)價(jià)油脂整體氧化程度的指標(biāo)，計(jì)算公式為

TV=4PV+p-AnV

式中：PV為油樣過氧化值；p-AnV為油樣p-茴香胺值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行測定3次，使用方差分析。樣品間的差異采用SPSS 16.0 Duncan法進(jìn)行顯著性分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對(duì)紫蘇葉中黃酮提取的影響

微波功率對(duì)紫蘇葉中黃酮的提取效果的影響見圖1(a)。由圖1(a)可知：細(xì)胞膜上的分子在微波作用下產(chǎn)生瞬時(shí)極化，增加分子鍵的振動(dòng)、撕裂和粒子之間的摩擦與碰撞，進(jìn)而使得細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞液中的活性物質(zhì)擴(kuò)散到溶劑中[13]。隨著微波功率的增加，分子運(yùn)動(dòng)越劇烈，黃酮提取量也越大。當(dāng)微波功率過大時(shí)，可能導(dǎo)致活性物質(zhì)間產(chǎn)生副作用，使提取率下降，因此，紫蘇葉中黃酮提取的最佳微波功率為400 W。

2.1.2 料液比對(duì)紫蘇葉中黃酮提取的影響

料液比對(duì)紫蘇葉中黃酮的提取效果的影響見圖1(b)。由圖1(b)可知：當(dāng)料液比m(紫蘇葉)∶V(乙醇)為1∶8～1∶12 g/mL時(shí)，紫蘇葉中黃酮提取量隨著料液比的增加而增加，低于1∶12 g/mL后，黃酮提取量趨于平緩甚至?xí)p少。在溶劑乙醇相對(duì)低的時(shí)候，紫蘇葉無法完全浸潤，適當(dāng)增加溶劑，使得紫蘇葉細(xì)胞內(nèi)外濃度梯度擴(kuò)大，傳質(zhì)動(dòng)力提高，黃酮提取量隨之增加，因此選擇料液比m(紫蘇葉)∶V(乙醇)分別為1∶10，1∶12，1∶14 g/mL做進(jìn)一步研究。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)紫蘇葉中黃酮提取的影響

提取時(shí)間對(duì)紫蘇葉中黃酮提取的影響見圖1(c)。由圖1(c)可知：隨著提取時(shí)間的增加，紫蘇葉中黃酮提取量先增加后減少，提取時(shí)間為35 min時(shí)，提取量最大。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長，由于微波的作用，使得細(xì)胞破裂，提取率升高。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到一定值后，有效成分大部分?jǐn)U散出來，溶液內(nèi)部達(dá)到一定的平衡，延長提取時(shí)間對(duì)提取量的增加沒有效果，因此選擇提取時(shí)間為30，35，40 min做進(jìn)一步研究。

圖1 紫蘇葉黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn)Fig.1 Single factor experiment on flavonoids extraction from Folium perillae

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇微波功率(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)為考察因素，以紫蘇葉中黃酮提取量為考察指標(biāo)，使用Design-Expert 8.5程序輔助設(shè)計(jì)Box-Behnken三因素三水平優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[14]。實(shí)驗(yàn)共有17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，包括12個(gè)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)和5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.1 回歸模型有效性及顯著性分析

按照表2響應(yīng)面的結(jié)果用Design-Expert 8.5軟件實(shí)施回歸擬合分析，并對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。經(jīng)回歸擬合得到微波功率、料液比和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量(Y)影響的二次多項(xiàng)回歸模型為

Y=7.00+0.42A+0.23B+0.51C-0.15AB+

0.18AC-0.25BC+1.7BD-0.82A2-

0.356B2-0.52C2

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，模型的p值小于0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)p值大于0.05，不顯著，表明該模型擬合度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，結(jié)果切合實(shí)際[15]。因此，可利用該模型對(duì)紫蘇葉黃酮提取的最佳工藝條件進(jìn)行分析。由表3中p值可知：微波功率、料液比和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響達(dá)極顯著水平(p<0.01)，且料液比與提取時(shí)間的交互作用達(dá)到了極顯著的水平。另外，由F值可知對(duì)紫蘇葉中黃酮提取影響大小的排列順序?yàn)椋何⒉üβ?提取時(shí)間>料液比。

2.2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

根據(jù)回歸方程，繪出響應(yīng)面分析圖和等高線圖，見圖2。從圖中可直觀地看出各因素對(duì)紫蘇葉中黃酮提取量的影響，響應(yīng)面的最高點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的影響因素取值可以判定為最佳條件。另外，兩因素間交互作用越顯著，其等高線圖形越接近于橢圓形，反之，越接近于圓形[16]。

通過對(duì)回歸方程求解，得出對(duì)紫蘇葉中黃酮提取的最優(yōu)條件為微波功率430.61 W，料液比m(紫蘇葉)∶V(乙醇)=1∶12.14 g/mL，提取時(shí)間32.65 min，理論黃酮提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.20 mg/g。綜合實(shí)際條件，將提取工藝調(diào)整為微波功率430 W，料液比1∶12 g/mL，提取時(shí)間32 min，此條件下，黃酮的提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.18 mg/g，與預(yù)測值基本吻合，說明該優(yōu)化模型準(zhǔn)確可靠，能夠?yàn)楦纳谱咸K葉黃酮提取工藝提供指導(dǎo)與幫助。

2.3 紫蘇葉黃酮對(duì)大豆油品質(zhì)的影響

過氧化值是衡量油脂氧化初期形成的氫過氧化物含量的一個(gè)重要指標(biāo)，但氫過氧化物性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫下易分解為醛、醇和酮等物質(zhì)，因此，過氧化值是氫過氧化物生成和分解的綜合結(jié)果[17]。紫蘇葉黃酮有一定的抗氧化作用，不同添加量的紫蘇葉黃酮對(duì)過氧化值的影響見圖3(a)。由圖可知：隨著加熱時(shí)間的延長，添加紫蘇葉黃酮的大豆油和空白對(duì)照組油樣的過氧化值均呈先升高后平緩的趨勢；加熱的前2 h內(nèi)過氧化值升高趨勢明顯，此時(shí)氫過氧化物處于大量生成中；繼續(xù)加熱，大豆油的過氧化值趨于平緩，可能是在此過程中氫過氧化物處于生成和分解的平衡點(diǎn)上。添加了紫蘇葉黃酮的大豆油，其過氧化值均低于空白組，并且隨著紫蘇葉黃酮添加量的增加，其過氧化值越小，這主要是由于紫蘇黃酮在加熱過程中可提供活潑氫，進(jìn)而參與到大豆油初級(jí)氧化的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，起到了一定的抗氧化作用。由此可知，紫蘇葉黃酮對(duì)大豆油煎炸過程中過氧化值的升高具有微弱的抑制作用。

酸價(jià)反映的是油脂中游離脂肪酸含量的多少，是判斷食用植物油品質(zhì)的有效指標(biāo)。油脂的酸價(jià)越高就越容易發(fā)生氧化酸敗，不同添加量的紫蘇葉黃酮對(duì)酸價(jià)的影響見圖3(b)。由圖可知：隨著加熱時(shí)間的延長，添加紫蘇葉黃酮的大豆油和空白油樣的酸價(jià)都有所增加。大豆油酸價(jià)升高主要是由于在加熱過程中大豆油中甘油三酯的斷裂及不飽和甘油三酯氧化生成的氫過氧化物都會(huì)分解生成一些小分子的酸[18]。從圖中也可看出：各個(gè)加熱時(shí)間段，添加紫蘇葉黃酮的大豆油樣酸價(jià)與空白油樣酸價(jià)相差非常微小，說明在加熱過程中紫蘇葉黃酮對(duì)大豆油酸價(jià)的升高幾乎沒有抑制作用。

p-茴香胺值反映的是油脂氧化產(chǎn)生的二次氧化產(chǎn)物中無揮發(fā)性的α-或β-不飽和醛類的含量，與油脂的酸敗程度密切相關(guān)[19]，不同添加量的紫蘇葉黃酮對(duì)p-茴香胺值的影響見圖3(c)。由圖可知：隨著煎炸時(shí)間的延長，添加紫蘇葉黃酮的大豆油和空白油樣的p-茴香胺值均呈逐漸上升趨勢，并且添加紫蘇葉黃酮的大豆油的p-茴香胺值小于空白對(duì)照，與空白樣品相比，添加0.5%紫蘇葉黃酮樣品的p-茴香胺值少了26.4%。由此可知，紫蘇葉黃酮對(duì)煎炸大豆油次級(jí)氧化產(chǎn)物的形成具有一定的抑制效果。

全氧化值是衡量油脂整體氧化程度的指標(biāo)[20]，不同添加量的紫蘇葉黃酮對(duì)全氧化值的影響見圖3(d)。由圖可知：紫蘇葉黃酮對(duì)大豆油加熱的p-茴香胺值和全氧化值的增加具有一定的抑制作用，且隨添加量的增加，抑制作用增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明：添加了紫蘇葉黃酮的大豆油在高溫加熱條件下的抗氧化性能較好，其效果隨著添加量的增加而增強(qiáng)。

圖3 不同添加量的紫蘇葉黃酮對(duì)大豆油的品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different addictive amount of Folium perillae flavone on soybean oil

3 結(jié) 論

筆者采用微波輔助乙醇提取紫蘇葉中的黃酮，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立紫蘇葉黃酮得率的二次多項(xiàng)回歸模型，優(yōu)化出微波輔助提取紫蘇葉黃酮的佳工藝條件為：微波功率430 W，料液比m(紫蘇葉)∶V(乙醇)=1∶12 g/mL，提取時(shí)間32 min，此條件下，黃酮的提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.184 mg/g，與理論值相接近，表明該模型可以較好地預(yù)測紫蘇葉黃酮的微波輔助提取得率。另外，紫蘇葉黃酮有較強(qiáng)的抗氧化作用，能顯著降低高溫下大豆油的過氧化值、p-茴香胺值和全氧化值，且效果隨著添加量的增加而增強(qiáng)，與空白樣品相比，添加0.5%紫蘇葉黃酮的樣品的p-茴香胺值少了26.4%，但對(duì)抑制大豆油加熱過程中酸價(jià)的增加不顯著。紫蘇葉黃酮對(duì)大豆油良好的保護(hù)效果表明其適合作為高溫烘烤含油食品的抗氧化添加劑。