多囊卵巢綜合征模型的構(gòu)建與分析

□亓妍妍 孟 欣 張 琳 門肖霞 賈新銳 齊萬學(xué)

多囊卵巢綜合征(PCOS)又名Stein-Leventhal綜合征，系下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調(diào)引起的生殖障礙與代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合征。其主要表現(xiàn)為持續(xù)無排卵、胰島素抵抗、高雄激素血癥及高胰島素血癥?；颊叨喑尸F(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)、量少，甚則閉經(jīng)、不孕而就診，除此之外還常伴有肥胖、多毛、黑棘皮癥及痤瘡等，嚴(yán)重的則可能引起乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和心腦血管等疾病。目前絕大多數(shù)PCOS實(shí)驗(yàn)都使用大鼠作為理想動(dòng)物模型[1]，因其規(guī)律且較短的動(dòng)情周期(4～5d)以及價(jià)格便宜可以大規(guī)模使用，常用的大鼠有SD和Wistar兩種。本文集合了近年來多位研究者從不同生理病理學(xué)角度、采用不同的造模方法建立的接近人類PCOS某些病情特征的動(dòng)物模型，現(xiàn)將各種多囊卵巢綜合征大鼠模型綜述如下。

一、雄激素造模法

(一)丙酸睪丸酮模型。丙酸睪酮(TP)為一類雄激素類藥物，而高雄激素表現(xiàn)如多毛、痤瘡等都是PCOS的主要臨床特征，這就給我們以提示：高雄激素血癥會(huì)使該疾病的基本內(nèi)分泌改變，而高雄激素水平也可能是導(dǎo)致PCOS的病因之一。所以丙酸睪酮模型就是通過外源注射高雄激素來達(dá)到干擾卵泡的生長(zhǎng)成熟，進(jìn)而出現(xiàn)不排卵的目的。

盛哲津等[2]將脂溶性藥物丙酸睪酮溶于中性茶油中，且將5～6日齡雌鼠，隨機(jī)分組，對(duì)照組小鼠皮下注射中性茶油溶液50μL，注射1次，建模組小鼠頸背部皮下注射丙酸睪酮溶液50μL(1mg丙酸睪酮)。NTO組(給予中性茶油的對(duì)照組小鼠)及丙酸睪酮處理模型小鼠(PCOS組)均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。檢測(cè)結(jié)果顯示雖然模型鼠的糖代謝正常，但其基礎(chǔ)血糖值較對(duì)照組有所升高(P<0.05)，模型小鼠出現(xiàn)陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化、交配見栓率、妊娠率顯著低于對(duì)照組，模型組胰島素水平雖有所升高卻與對(duì)照組無顯著性差異。卵巢卵泡和正常卵巢相比明顯成多囊樣發(fā)育，見囊狀擴(kuò)張卵泡。LH、FSH都處于低水平(<0.1U/L)，血游離睪酮水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，孕酮水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.01)。以上這些結(jié)果表明此次建模部分模擬了人PCOS的臨床特點(diǎn)，因此，該方法制備的多囊卵巢綜合征小鼠動(dòng)物模型可以應(yīng)用于不孕癥以及多囊卵巢等的實(shí)驗(yàn)研究?？傮w來說該造模方法的優(yōu)點(diǎn)是模型持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)(>3個(gè)月)且操作簡(jiǎn)便，利于臨床實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察。缺點(diǎn)是成模時(shí)間不確定，卵巢形態(tài)學(xué)結(jié)果不足以作為成模的依據(jù)。

(二)脫氫表雄酮模型。研究發(fā)現(xiàn)，大部分PCOS患者多在青春期時(shí)便表現(xiàn)出腎上腺分泌雄激素增多，脫氫表雄酮硫酸鹽(DHEAS)和血清脫氫表雄酮(DHEA)水平升高。推測(cè)可能DHEA的升高是導(dǎo)致PCOS的一個(gè)重要原因[3]。脫氫表雄酮是睪酮生物合成中的一個(gè)中間產(chǎn)物，經(jīng)△5途徑合成睪酮，如通過外源途徑提升DHEA水平也可以造成雄烯二酮水平增高，而睪酮及雌酮水平的升高，就會(huì)導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯，從而發(fā)生排卵障礙。

李燕等[4]將大鼠從23日齡開始：對(duì)照組皮下注射油劑(注射用茶油，下同)，注射量為0.2mL/100g；造模組每天早晨于頸背部皮下注射脫氫表雄酮溶液(濃度為30mg/mL，注射量為0.2mL/100g體重)，連續(xù)注射20d。經(jīng)檢測(cè)得知從23～43日齡，SD雌大鼠體重約為50～150g，所以注射液用量應(yīng)在0.1～0.3mL之間浮動(dòng)。其結(jié)果顯示造模組卵巢表現(xiàn)出閉鎖卵泡增多、多囊樣改變、閉鎖卵泡直徑明顯大于對(duì)照組。造模組血清空腹血糖水平、FSH、T及體質(zhì)量等方面都明顯升高(P<0.05)。綜上所述，該模型的優(yōu)點(diǎn)是該法更接近PCOS的發(fā)病機(jī)制，造模周期相對(duì)較短(20d)，解決了丙酸睪丸酮造模時(shí)間過長(zhǎng)(>3個(gè)月)的問題，且重復(fù)性較好，能很好地模擬人PCOS卵巢生理和形態(tài)學(xué)改變，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外常用的建模方法。但其缺點(diǎn)也在于DHEA的原料藥不溶于水，以往文獻(xiàn)采用的造模方法均為DHEA溶于注射用油進(jìn)行皮下注射，但油劑皮下吸收較緩慢進(jìn)而導(dǎo)致注射部位形成硬結(jié)，會(huì)影響藥物的進(jìn)一步吸收。由于人PCOS與通過外源注射雄激素所建立起來的動(dòng)物模型在對(duì)治療的反應(yīng)、形態(tài)及激素改變等許多方面都有很大差別，故停用DHEA后恢復(fù)排卵的周期仍有待進(jìn)一步商榷。

(三)硫酸普拉睪酮鈉模型。張娟等[5]用DHEA硫酸鈉鹽制劑硫酸普拉睪酮鈉9mg/100g/日皮下注射23日齡雌性大鼠20d，結(jié)果顯示經(jīng)硫酸睪酮鈉皮下注射20天后，其卵巢重量顯著升高，卵泡的囊性擴(kuò)張數(shù)變多，卵泡內(nèi)放射冠或卵母細(xì)胞逐漸消失，至于顆粒細(xì)胞層則變薄甚至消失，其細(xì)胞排列呈現(xiàn)松散狀態(tài)，卵泡膜細(xì)胞出現(xiàn)增生；血清E2、T濃度明顯增加。說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜔o論從病理學(xué)形態(tài)變化，還是血清激素水平都與多囊卵巢綜合征病人相似，故可作為一種較理想的用于研究多囊卵巢綜合征的動(dòng)物模型。

二、孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素(HCG)造模法

該方法是基于Bogovich等[6]在1989年首先采用的模型。國(guó)內(nèi)朱亮等[7]也對(duì)其進(jìn)行了研究，具體造模過程為：選取24日齡SD雌性大鼠，模型組將左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒皮下埋植注入，3mm/只，3d后(27日齡)開始皮下注射人絨毛膜促性腺激素1.5×103U/L，一天兩次。對(duì)照組在第27日開始每天皮下注射等體積生理鹽水，注射9d后觀察。結(jié)果顯示模型組大鼠卵巢皮質(zhì)內(nèi)的各發(fā)育期黃體及卵泡少見，卵巢表面呈現(xiàn)蒼白狀態(tài)；可見呈囊性擴(kuò)張的卵泡，其內(nèi)部的放射冠或卵母細(xì)胞消失；卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增生；顆粒細(xì)胞層數(shù)減少為2～3層，且排列疏松。由電鏡可見卵泡膜內(nèi)E2變化不明顯而大量睪酮、血清孕酮、脂滴等卻明顯增高。模型組大鼠血清空腹血糖(FBG)值、空腹胰島素(FINS)值、HOMA指數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。究其方法機(jī)制為用避孕硅膠棒可抑制下丘腦-垂體-卵巢軸，使性激素分泌速率變低，導(dǎo)致不排卵。而HCG在各方面都比LH(促黃體生成素)更強(qiáng)，進(jìn)而使原來的正常內(nèi)源性促黃體生成素脈沖式分泌模式遭到破壞，最終使SD大鼠的血清睪酮明顯增加。因目前尚無LH制品，HCG的生物作用和化學(xué)結(jié)構(gòu)與LH類似，故聯(lián)合使用HCG來造PCOS動(dòng)物模型。對(duì)于優(yōu)點(diǎn)可以總結(jié)為：皮下埋植劑緩慢、恒定的釋放，實(shí)驗(yàn)周期短、重復(fù)性好且操作簡(jiǎn)單。該方法在于雖未使LH水平顯著升高，卻使大鼠模型同時(shí)具備了胰島素抵抗、雄激素水平升高和LH/FSH升高這三大PCOS典型生理病理改變，這是極其關(guān)鍵的。而缺點(diǎn)就在于可能影響促排卵藥物的治療效果，不適合促排卵藥物的藥效研究。

三、胰島素(INS)聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素(HCG)造模法

本方法由Poresky[8]創(chuàng)建，他在前人[9]基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)高胰島素的環(huán)境可促使LH樣作用下的囊性卵泡和卵巢體積增長(zhǎng)，于是選擇85日齡SD雌性大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分組，其中一組每天2次在皮下注射1.5IUHCG；還有一組皮下注射胰島素，于第1～10日從0.5U/d逐漸加量到6.0U/d，并按此劑量維持；另一組同時(shí)注射HCG和INS，共注射22d。在第23天斷頭處死，觀察各項(xiàng)常見的PCOS病理生理水平發(fā)現(xiàn)單用HCG會(huì)發(fā)生卵巢的單側(cè)或雙側(cè)多囊樣改變，有小囊泡生成。單純使用胰島素者雖胰島素水平有些許升高但并未發(fā)生PCOS樣改變，而胰島素加HCG則出現(xiàn)了PCOS樣卵巢和無排卵。INS聯(lián)合HCG和單用HCG多囊樣改變的發(fā)生率分別為80%、60%[10]。該模型的組織學(xué)符合人體PCOS改變，并通過HE電鏡觀察陰道涂片從而證實(shí)了無排卵；內(nèi)分泌變化方面則出現(xiàn)了由胰島素引起的持續(xù)存在的高胰島素血癥和外源性HCG造成的大鼠體內(nèi)長(zhǎng)期存在的LH樣作用，并由此誘導(dǎo)出高雄激素血癥。其原理在于HCG能抑制卵泡顆粒細(xì)胞有絲分裂使顆粒細(xì)胞數(shù)量變少，而胰島素能刺激卵巢卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞合成雄激素，降低血中SHBG(性激素結(jié)合蛋白)含量，從而使雄激素的濃度升高，兩者共同作用下，便出現(xiàn)了高雄激素血癥及卵泡閉鎖，形成多囊癥狀。該方法總體來講具有卵巢多囊性改變，無排卵，體質(zhì)量升高，血清LH和胰島素顯著增加等PCOS樣特征，是目前國(guó)內(nèi)比較前沿的研究模型，但不足之處在于有排卵存在，見黃體組織較多、囊泡直徑較大，這與PCOS患者的臨床癥狀有些許差異，還不能用于胰島素抵抗方面的研究。

四、芳香化酶抑制劑法

在本造模法中芳香化酶抑制劑主要指的是來曲唑(Letrozole)，它是由Kafali等[11]首次采用非類固醇的芳香化酶抑制劑建立的一種PCOS動(dòng)物模型。它能用來建模主要是由于芳香化酶是將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素最后一步的限速酶，它可以將睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)變成E2和雌酮。來曲唑作為一種芳香化酶抑制劑能夠抑制雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)換，可導(dǎo)致卵巢生成類固醇激素功能紊亂，產(chǎn)生過多的雄激素，進(jìn)而引發(fā)PCOS癥狀的無排卵和卵泡閉鎖現(xiàn)象。

袁琪等[12]將清潔級(jí)6周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組用1%羧甲基纖維素灌胃，模型組則灌服溶于1%羧甲基纖維素的來曲唑，給藥劑量為1mg/kg/d，兩組連續(xù)灌服21天。于干預(yù)期完之后處死大鼠，經(jīng)過處理和檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)模型組所有大鼠失去穩(wěn)定動(dòng)情周期且均處于間期，其雙側(cè)卵巢重量、體質(zhì)量均增加，卵巢多囊樣發(fā)生改變，白膜增厚，與之對(duì)應(yīng)的是黃體數(shù)目明顯減少。除此之外，模型組在血清FINS、T、LH等方面水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，P水平明顯低于正常對(duì)照1組，F(xiàn)SH相比之則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜合來講，該種模型在內(nèi)分泌改變還有局部性腺的解剖、組織學(xué)改變方面都有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，尤其是在卵巢形態(tài)學(xué)改變方面有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)，是研究多囊卵巢綜合征胰島素抵抗和發(fā)病機(jī)制令人信服的模型方法之一。而缺點(diǎn)恰恰就在于造模費(fèi)用高昂，E2水平明顯降低，因此不適合研究雌激素水平較高的PCOS。

五、雌激素造模法

該方法多為戊酸雌二醇(EV)造模法。其理論基礎(chǔ)為高雌激素刺激會(huì)導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)元退化，垂體出現(xiàn)代償性增生，使垂體對(duì)GnRH刺激的敏感性增加，靜脈推注GnRH也會(huì)致使LH升高，而且雌激素的持續(xù)刺激更是對(duì)垂體FSH有強(qiáng)烈的抑制作用，從而出現(xiàn)PCOS垂體內(nèi)分泌環(huán)境的典型特征。

邵華等[13]采用的是將雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、低劑量組及高劑量組?？瞻捉M不做任何處理；對(duì)照組給予一次性肌內(nèi)注射0.2ml植物油；低劑量組一次性肌內(nèi)注射含EV2mg的0.2ml油劑；高劑量組一次性肌內(nèi)注射含EV4mg的0.2ml油劑。于造模后15d、30d、60d各階段每組各處死3只大鼠，取卵巢，HE染色進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示高、低劑量模型組均出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂，其30d后的卵巢表面顏色蒼白，體積變小，卵泡呈現(xiàn)多囊狀擴(kuò)張。高劑量組比低劑量組的囊狀卵泡體積更大，數(shù)量更多，顆粒細(xì)胞排列也更不規(guī)范。但值得注意的是，血清中睪酮和雄烯二酮水平卻無明顯差異。通過本實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果分析可知2mg和4mg都可使大鼠動(dòng)情周期紊亂且卵巢表現(xiàn)出多囊樣改變，而且隨著油劑在體內(nèi)緩慢吸收，作用時(shí)間延長(zhǎng)，卵巢多囊樣改變愈加充分。EV誘導(dǎo)的多囊卵巢大鼠模型在垂體、卵巢、下丘腦的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá)增多也進(jìn)一步論證了Elisabet Stener-Victorin等[14]關(guān)于交感神經(jīng)興奮性增加在多囊卵巢形成過程中發(fā)揮著重要作用的理論。綜上所述，因本方法的卵巢形態(tài)學(xué)改變及激素分泌水平與人PCOS相似，雖未見有關(guān)于脂、糖代謝失調(diào)的研究進(jìn)展，但可作為以生殖內(nèi)分泌失調(diào)為主的PCOS動(dòng)物模型。

六、結(jié)語

以上為現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外采用比較多的PCOS動(dòng)物模型建立方法，由于多囊卵巢綜合征是一種臨床表現(xiàn)多態(tài)性的疾病，其發(fā)病機(jī)制的多因性，臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性和復(fù)雜性都限制了上述各種造模方法都只能以單方面的特性或者某些方面特性來剖析和構(gòu)建PCOS模型。由于PCOS是一種高度異質(zhì)性的疾病，要找到一個(gè)能完全模擬人PCOS臨床特點(diǎn)的動(dòng)物模型也是不太現(xiàn)實(shí)的，所以還是應(yīng)該根據(jù)研究目的來選擇合適的模型。另外，研究者們也仍在努力探索和嘗試新的誘導(dǎo)方法，希望能建立更為理想的PCOS動(dòng)物模型。近年來，人們?cè)趦?nèi)分泌學(xué)、形態(tài)學(xué)等方面的研究力度進(jìn)一步加深，尤其是對(duì)于細(xì)胞更深層次的探索，如細(xì)胞水平、基因水平等[15]，但尚處于初步探究階段。相信隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的不斷發(fā)展，未來將會(huì)建成更為理想、更公認(rèn)、更符合發(fā)病機(jī)制的多囊卵巢綜合征大鼠動(dòng)物模型，從而推動(dòng)PCOS研究及治療方法的進(jìn)步。