DC-CIK細胞免疫療法在肝細胞癌治療中的應用進展

何英瓊(綜述)，蘇中振(審校) （中山大學附屬第五醫(yī)院超聲科，廣東珠海）519000

提 要：肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，病死率高，大部分患者患病時已失去最佳手術治療時機。目前主要的保守治療方法有超聲引導下腫瘤射頻消融 、肝動脈栓塞療法、生物免疫治療以及分子靶向治療等。因肝癌是一種免疫相關疾病，為探索有效的細胞免疫治療方案，提高患者生存率及生活質量，該文就樹突狀細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞(DC-CIK)免疫療法在肝癌治療中的應用進行了綜述。

肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，尤其是原發(fā)性肝癌 (hepatocellularcarcino， HCC)預后差，多數患者被發(fā)現患病時已失去手術根治的機會，據統計只有9%～27%的患者具有手術機會[1]，故治療手段主要依賴保守治療如超聲引導下腫瘤射頻消融、肝動脈栓塞療法、生物免疫治療以及分子靶向治療等。因肝細胞癌也是一種免疫相關性的疾病，患者存在腫瘤免疫應答及啟動免疫應答方面的缺陷，故各種保守治療手段不僅不能有效清除腫瘤病灶，而且經治療后患者自身的免疫功能下降，更容易導致殘留病灶復發(fā)及轉移。如何提高患者自身免疫能力抑制腫瘤復發(fā)成為治療中的難點。

1 樹突狀細胞與細胞因子誘導的殺傷細胞

近年來，細胞生物免疫療法成為治療腫瘤的一種重要輔助手段。其中較為突出的是樹突狀細胞(Dendritic cells， DC)以及細胞因子誘導的殺傷(Cytokine-induced killercells， CIK)細胞， DC 和 CIK是人體攻擊腫瘤細胞重要的效應細胞，經過體外擴增培養(yǎng)再會輸患者自身，這些特異性淋巴細胞通過黏附因子途徑與腫瘤細胞相結合，能穿透腫瘤細胞膜并裂解腫瘤細胞[2]。

1.1 DC的生物學特性及其抗瘤機制

DC是至今所發(fā)現的具備抗原遞呈功效最強的細胞，主要表現在能明顯引誘靜止 T淋巴細胞增殖和應答，并促進細胞毒性 T 細胞生成方面。 CD34或CD14 細 胞是 DC的前體細胞，主要抗腫瘤機制有如下：(1)首先促使體內誘導產生大量效應 T細胞；(2)使活化的效應 T細胞遷移，并集中在腫瘤局部；(3)保持已經趨化的效應 T細胞在腫瘤部位長期存在；(4)促進體內白細胞介素 (I n terleukin， IL )12、粒細胞-單核細胞集落刺激因子 IL -1、腫瘤壞死因子等細胞因子的分泌；(5)抑制腫瘤血管生成。

1.2 CIK細胞的生物學特性及抗瘤機制

1.2.1 CIK 生 物學特性 CIK 細胞是來自人體外周血單個核細胞 (來自自體或異體外周血、臍帶血或骨髓等)在體外經各種細胞因子誘導后而培養(yǎng)的新型具備抗腫瘤免疫活性的細胞群，又稱為 N K細胞樣 T淋巴細胞，其中 CD3、 CD4、 C 8和 D 56細胞等異質細胞群是主要的效應細胞。 T淋巴細胞和 N K細胞在抗腫瘤方面的作用表現在能實行免疫監(jiān)視、殺傷腫瘤細胞及免疫調節(jié)等方面。因 T淋巴細胞的表面標志CD3和NK 細 胞表面標志 CD56 能 夠在CIK 細胞的細胞膜表面表達，故 CIK細胞同時具備 T淋巴細胞的細胞毒效應以及 N K細胞介導的非主要組織相容性復合體來限制性來抑制和殺傷腫瘤細胞。

1.2.2 CIK 細 胞治療肝癌的機制[3](1 )CIK 細胞促進機體的 CD3、 CD4、 CD3/CD4 T淋巴細比例和CD56的升高，這些細胞毒性 T效應細胞能夠直接殺傷腫瘤細胞；(2)促進機體分泌大量細胞因子，如 IL -2、干擾素、腫瘤壞死因子等，從而為 CD3、CD4、 CD8、CD56等細胞產生同源二聚體蛋白，進一步發(fā)揮抗腫瘤效應；(3)促使腫瘤細胞的表面受體和效應淋巴細胞的相關抗原結合，然后通過釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒起到直接殺傷靶細胞作用；(4)通過表達FasL(II型跨膜糖蛋白)， FasL 能夠與腫瘤細胞膜所表達的 Fas(I型跨膜糖蛋白)相結合，從而誘導腫瘤細胞的凋亡；(5)CIK細胞能降低肝細胞癌患者 AFP、ALT和AST水平，改善肝功能，提高患者生存質量。

1.3 DC-CIK共培養(yǎng)抗瘤機制

DC的效應是能夠識別病原從而激活機體獲得性免疫反應， CIK效應是針對病原時能夠發(fā)揮自身的細胞毒性作用和通過分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞。DC與CIK各自的效應能相互影響，經共同培養(yǎng)后可以互相促進彼此的成熟，主要機制是 DC所分泌的IL-2、 IL -12、IFN-7 等 因子能促使 CIK 的成熟，共培養(yǎng)后 CIK中的 CD3、 CD8、 CD56亞群含量有不同程度的升高。另外 ， DC-CIK共培養(yǎng)后， CIK中免疫抑制 T細胞亞群的含量明顯降低，從而實現進一步增強CIK的殺瘤效應， CIK還能提高 DC 和共刺激分子抗原遞呈的特異性作用。

2 目前采集單個核細胞的常用方法[4-5]

使用采血機采集患者外周血單個核細胞(PBMC)，數量控制為(1 ～4)× 109個，總容積為40～70 mL為宜。在符合要求的實驗室中，經 F icoll 淋巴分離液梯度離心，用 3次得到純凈的 PBMC，數量達(1 ～3)×107個。取得的 P MBC用 無血清培養(yǎng)液調至細胞密度達 2 ×106/mL后放置在細胞孵箱中孵育 2h， 待單核細胞貼壁，收集上層懸浮細胞用于制備CIK細胞，方法為使用無血清培養(yǎng)液調至細胞密度為(1～2)×106/ mL 時 ，在培養(yǎng)體系中加入 rhIFN-γ， 24h 后加CD3單克隆抗體、 rh IL-1a和rh IL-2，用來刺激CIK 的生長和增殖，每 3天換液并補加 rh IL-2，培養(yǎng)第 7天后即可收集 CIK。在剩余的附壁細胞中加入rh-GMCSF 和 rh IL-2的無血清培養(yǎng)液，置于細胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，從而誘導單核細胞分化轉向 DC；每 3天換液并補充細胞因子，在培養(yǎng) 6d后，培養(yǎng)液中加入rh-TNF-a，進一步誘導DC 成 熟；培養(yǎng)第7 天以后就可收獲成熟的 DC。收集以上所獲得的 DC和 CIK，按1:10比例共同培養(yǎng)，在無血清培養(yǎng)液中添加 rhIL-2，每隔 3天換液并補加 rh IL-2，培養(yǎng)第 7天就可收集DCCIK， 培養(yǎng)得到的細胞數量應超過 1 ×1010個。 在整個培養(yǎng)過程中應使用顯微鏡對 DC和 CIK情況進行觀察，在收集共培養(yǎng)的細胞前應進行細菌、真菌培養(yǎng)及內毒素等檢測，確保共細胞成品的外源性因子，如細菌、真菌、內毒素等均為陰性，細胞存活率超過 95%。除上述常規(guī)培養(yǎng)外，另有研究發(fā)現DCCIK 與 腫瘤射頻消融(Radiofrequency ablation, RFA)后的裂解物蛋白共同培養(yǎng)，形成的 Ag-DC-CIK細胞抗瘤活性更強[6]。 Shi等[7]在培養(yǎng) CIK時發(fā)現用羥乙基淀粉(HES)沉 降法收集的 CIK前 體(Pre-CIK)細胞比密度梯度離心法(Ficoll法)所收集的細胞免疫活性更強。如何使培養(yǎng)的 DC-CIK細胞抗腫瘤活性更強，維持時間更長久，也是研究的重點。

3 DC-CIK國內外抗肝癌研究進展

目前對 DC-CIK細胞治療的應用主要在非小細胞肺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤、胰腺癌和腎癌等方面，應用在肝癌的治療上研究較少。有文獻表明，通過將體外培養(yǎng)的 DC-CIK細胞回輸患者本身能提高肝癌體內 T H1、 CD3、 CD4細胞因子水平，并促進肝功能恢復[8]。 CIK細胞免疫療法不損害機體免疫系統，不僅能直接殺傷腫瘤細胞，還能同時清除殘留病灶，防止原發(fā)性肝癌的復發(fā)，并能改善患者的生活質量[9]。經體外人工培養(yǎng)的 CIK細胞還能分泌多種抑制腫瘤的細胞因子，通過有效調節(jié)機體免疫系統，進而間接殺傷腫瘤細胞；此外， CIK細胞還能激活腫瘤細胞的凋亡基因，進一步促使腫瘤細胞凋亡[10]。

有研究表明[11]，早期肝癌患者經過TACE+RFA+CIK 治 療，較未經 CIK 細胞免疫治療者總生存率更高，與外科手術治療后的總生存率相似[12]。賈詠存等[13]研究表明，DC-CIK細胞免疫治療可降低原發(fā)性肝癌患者外周血 CD4+CD25+調節(jié)性 T細 胞的百分數，提高患者 T hl類細胞因子水平，是原發(fā)性肝癌的重要有效輔助手段。另有文獻報導肝癌患者經過使用 DC-CIK細胞治療后，測得其外周血清甲胎蛋白(AFP)、 H ‐ 亞基鐵蛋白(HF)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原 199(CA199)水平較治療前降低[14]。 L ee等[15]對230位I/II期肝癌患者進行了多中心、隨機試驗，結果發(fā)現接受了活化的 CIK免疫細胞治療的患者無復發(fā)和總生存率明顯優(yōu)于對照組。另外，研究還發(fā)現CIK細胞除了直接殺滅腫瘤作用外，還可能通過控制 H BV的復制間接降低腫瘤的復發(fā)。 L ee等[16]進行的長達 5a的大樣本隨機試驗發(fā)現，使用 CIK 細胞治療的肝癌患者其生存期更長，復發(fā)及死亡風險顯著降低； C hen等[17]針對 DC細 胞的治療也表明，接受DC細胞治療的肝癌患者不僅生存率提高，也無明顯副作用，安全性高。

DC-CIK細胞免疫治療在其他抗腫瘤方面，高會霞[18]在放化療聯合使用 DC-CIK細胞治療局部晚期的非小細胞肺癌患者臨床療效及生存期研究中發(fā)現，使用 DC-CIK細胞治療的患者臨床療效顯著提高，生存期明細延長。焦蘭等[19]在局部晚期乳腺癌患者研究發(fā)現化療聯合DC-CIK細胞治療后的患者外周血細胞CD3+CD8+、 CD3+CD56+的細胞比例明顯升高。與治療前比較，聯合治療組患者治療后 T細胞分泌IFN-y、IL-2水平顯著升高。劉慶等[20]在晚期結直腸癌患者的研究中也發(fā)現，應用 DC-CIK細胞聯合常規(guī)化療的患者外周血中 CD4+和 CD4+/ CD8+明顯提高，且患者體內 CD168、 CD133、 CD151等腫瘤促進分子的含量與對照組患者相比明顯降低，而 CD9和 CD63等腫瘤抑制分子的含量明顯高于對照組患者，干擾素γ(I F N-γ)的含量也顯著升高；另外還發(fā)現未經DCCIK細胞治療的患者單純接受化療后的 B 7-H4蛋白表達無明顯改變，而觀察組患者治療后的可溶性B7-H4 蛋 白表達明顯降低。因 B 7-H4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性表型以及腫瘤免疫密切相關[21]，高表達的B7-H4可以促進腫瘤的發(fā)生，促進腫瘤細胞發(fā)生上皮細胞-間充質轉化(EMT)。這進一步提示了DCCIK細胞治療后能夠通過減少B7-H4的蛋白表達來發(fā)揮調節(jié)患者免疫功能的作用。

由上可見， DC-CIK細胞不管在治療肝癌或者其他腫瘤的效應機制有共通之處，都是通過刺激機體分泌更多的能抑制腫瘤效應的細胞因子，下調促腫瘤因子，并通過調節(jié)腫瘤凋亡的相關信號分子及通路，但目前對此具體機制尚未完全清楚，相關研究猜測可能是該過程的發(fā)生可能與 B cl-2/Bax比例失調有關[22]。 Q ian等[23]研究發(fā)現，抑制該基因的表達，能夠促進細胞內促凋亡蛋白 B ax表達，同時抑制抗凋亡蛋白 B cl-2的生成，通過調節(jié)兩者的蛋白表達含量及比例，最終促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。另外，也有研究發(fā)現，抑制該基因后，可使細胞外信號調節(jié)激酶 1 /2erk等的激活，并促進腫瘤細胞凋亡[24]。

另外，目前對肝癌的治療方法雖多，但病死率居高不下，侵襲和轉移是導致肝癌腫瘤患者死亡的重要原因。近年來，上皮 – 間質轉化(EMT)在腫瘤轉移中的作用受到越來越多的關注，已有研究表明，肝癌的轉移、侵襲均與 EMT有關[25]。 EMT是 指上皮細胞受某些刺激因素失去上皮特性，細胞的極性、細胞間緊密連接和黏附連接減少甚至丟失，失去正常的細胞結構，變得孤立和易游走轉移，抗凋亡能力變強。 EMT也會促使一些參與細胞外基質和基底膜降解和破壞的溶解酶如基質金屬蛋白酶(MMP)高表達, 破壞組織學屏障, 便于細腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉移。 MMPs還與血管內皮生長因子(VEGF)共同參與腫瘤血管形成，進一步促進腫瘤侵襲。EMT發(fā)生后，阻礙腫瘤細胞的早衰和凋亡，改變了腫瘤的微環(huán)境，使他們逃脫機體免疫系統的監(jiān)視和清除。而 DC-CIK細胞免疫治療正是重新調節(jié)腫瘤的微環(huán)境，激活相關腫瘤殺傷因子，如白細胞介素(interleukin， IL )、粒細胞-單核細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子等，也可抑制腫瘤新生血管生成，通過各種機制抑制腫瘤 EMT化，從而降低肝癌細胞的侵襲和轉移，目前對 DC-CIK抑制肝癌細胞 EMT的信號通路尚不清楚。

4 DC-CIK治療安全性

DC-CIK細胞免疫治療屬于過繼性免疫治療，與其他同類過繼性免疫療法的細胞如嵌合抗原受體修飾的T細胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CRT-T)不同，其發(fā)生的脫靶效應、細胞因子釋放綜合征和移植物抗宿主病樣損傷的不良反應未見報道， DC-CIK臨床上主要以失眠、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、興奮等為主，也未見明確器官損害的報道。有研究觀察 DC-CIK細胞治療Ⅲ期非小細胞肺癌的患者，在隨訪 36個月后，僅發(fā)現有 3名患者出現寒顫發(fā)熱[26]。在高會霞[18]的研究中同樣表明在聯合應用DC-CIK細胞治療后，局部晚期的非小細胞肺癌患者出現惡心嘔吐、Ⅲ～ Ⅳ級骨髓抑制以及周圍神經毒性等副作用的概率均相比單純同步放化療低，提示DC-CIK細胞治療可明顯改善患者的體力以及食欲；另外，有其他研究發(fā)現，長期進行單純的化療會導致腫瘤細胞產生耐藥性，而 DC-CIK細胞的細胞免疫治療可通過攻擊腫瘤細胞表面過度表達的耐藥蛋白達到降低腫瘤耐藥性的作用 ，從而提高化療藥物殺傷作用[27]。

綜上所述 ，使用 DC-CIK細胞免疫療法可以短期內提高肝癌患者的免疫力，調節(jié)患者血清腫瘤干細胞標志物水平，改善肝功能情況；從遠期看，減少或抑制腫瘤的侵襲和轉移，這對患者的預后及生存質量具有積極意義。另外， DC-CIK細胞免疫療法安全性高，為臨床治療肝癌提供新思路，值得進一步深入研究后在臨床上應用。