MR示蹤技術(shù)在干細胞治療心肌梗死中的研究進展

吳詩熳 張 華 姚振威*

目前心肌梗死仍然是威脅人類生命及生活質(zhì)量的主要原因之一，而自體移植干細胞治療心肌梗死已逐漸從實驗室研究走向臨床應(yīng)用，但仍然面臨著諸多困難，其中一個重要限制是移植細胞的示蹤和療效評價。干細胞治療的機制和功效仍然不確定，目前臨床多以心肌的形態(tài)學(xué)及功能學(xué)改變（如心臟射血分?jǐn)?shù)等）來評價干細胞治療的療效，但這些評估方法無法有效了解移植干細胞的存活、遷移、轉(zhuǎn)歸等生物學(xué)特性信息，且無法獲悉其在活體內(nèi)的分布。而研究中使用的示蹤劑標(biāo)記法監(jiān)測干細胞則必須在離體狀態(tài)下進行組織切片分析，如通過載體轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式改變細胞基因，使其表達特異性的標(biāo)志物（如熒光素酶和綠色熒光蛋白）[1]；利用染料標(biāo)記細胞；選用雄性供體和雌性宿主，利用Y染色體作為標(biāo)志物。這些方法都具有創(chuàng)傷性，難以應(yīng)用于臨床。因此亟需一種無創(chuàng)實時動態(tài)提供移植干細胞遷移、生存、分化以及器官功能改善整個過程的全部信息的活體示蹤技術(shù)。

心臟 MRI（cardiac MRI，CMRI）技術(shù)在臨床上一直是評價心室功能較全面的無創(chuàng)性成像技術(shù)，可準(zhǔn)確提供心室容積、質(zhì)量、形態(tài)和功能信息[2]。近年來，多種干細胞標(biāo)記技術(shù)與CMRI技術(shù)不斷結(jié)合，不僅可獲得精確的解剖信息，了解心功能及心肌存活狀況，還可長時程監(jiān)測干細胞遷移及生存等情況，即MR細胞示蹤成像技術(shù)。MR細胞示蹤成像通過MRI連續(xù)監(jiān)測，使活體細胞內(nèi)的特殊分子作為標(biāo)志物在MR上顯示，即把活體內(nèi)的生物學(xué)行為轉(zhuǎn)化為特異性分子影像，從而實現(xiàn)活體狀態(tài)下定性、定量研究生物體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)及功能變化[3]，可分為對比劑直接標(biāo)記細胞示蹤成像和MR報告基因成像。MR細胞示蹤成像的標(biāo)志物具有特異性高、親和力強、半衰期長（保證足夠時間成像）、標(biāo)記率高等特點，同時能在合適的磁場強度下改變弛豫率，最小檢測單位可達細胞水平[4]。本文綜述MR細胞示蹤成像技術(shù)的研究進展。

1 MR標(biāo)記細胞示蹤成像

1.1 順磁性對比劑 MRI對比劑是通過縮短組織縱向弛豫時間或橫向弛豫時間，使得T1WI或T2WI上的目標(biāo)成像區(qū)域產(chǎn)生高信號和低信號，從而達到區(qū)分目標(biāo)區(qū)域和周圍組織的效果。T1陽性對比劑[如釓（Gd3+）和錳（Mn2+）對比劑]能通過順磁金屬離子外殼中的不成對電子與附近水分子的直接相互作用來縮短T1，在T1WI上呈現(xiàn)高信號。釓對比劑（Gd－DTPA）屬于細胞外陽性對比劑，其細胞標(biāo)記效率低，且標(biāo)記后的釓存在于細胞內(nèi)，需較高濃度才能產(chǎn)生正性T1對比效應(yīng)，因此近年來釓對比劑用于心肌梗死的干細胞研究逐漸變少。Adler等[5]采用新型對比劑GdFM-Cy3標(biāo)記鼠胚胎干細胞衍生的心血管祖細胞，GdFM-Cy3的縱向弛豫率約為Gd-DTPA的6倍，且能在標(biāo)記細胞和對照細胞之間遷移，經(jīng)細胞排泄后其相鄰細胞仍能再攝取，避免了MR標(biāo)志物的稀釋，克服了傳統(tǒng)釓劑標(biāo)記細胞中的細胞內(nèi)區(qū)室化問題，減少細胞內(nèi)區(qū)室化對縱向弛豫率的影響。但由于未螯合的釓具有高毒性，對含釓的對比劑應(yīng)用于干細胞追蹤的安全擔(dān)憂依然存在。為減少釓信號的丟失和毒性，Carney等[6]合成了基于親脂性Gd（Ⅲ）的MR對比劑，可在體外標(biāo)記細胞膜，通過增加釓的有效負(fù)載從而放大MRI信號，但該研究應(yīng)用于腫瘤細胞，與干細胞治療的作用模式不能類比，因此釓劑標(biāo)記干細胞的技術(shù)還需要更多的探索。

另一種順磁性對比劑為氯化錳（MnCl2），錳以離子狀態(tài)即可作為細胞標(biāo)志物，不需要借助其他轉(zhuǎn)染物質(zhì)。MnCl2有望提高MRI活體示蹤干細胞的敏感性，Yamada等[7]研究表明MRI可示蹤亞毫摩爾濃度MnCl2標(biāo)記的移植干細胞，并評價干細胞在心肌梗死治療中的活性。2018年，Liu等[8]利用與錳離子螯合的黑色素（MNP-Mn）成功標(biāo)記了骨髓間充質(zhì)干細胞，表明MNP-Mn具有高的生物相容性。黑色素廣泛存在于人體，具有良好的金屬離子螯合能力，雖然該研究未用于心肌梗死治療的評價，但未來可以利用體內(nèi)類似的金屬離子螯合物作為靶點進行研究，將錳對比劑用于標(biāo)記心肌梗死治療的干細胞，可能安全性更高且更容易推廣到臨床。

1.2 化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移（chemical exchange saturation transfer，CEST）成像相關(guān)對比劑 CEST成像是使用射頻脈沖選擇性地飽和特定物質(zhì)（例如蛋白質(zhì)或多肽的酰胺質(zhì)子、葡萄糖、黏多糖等），這種飽和通過化學(xué)交換，進一步影響自由水的信號強度，因此通過檢測水的信號，可間接反映這種物質(zhì)的信號。 Pumphrey 等[9]用銪-10-（2-羥丙基）－1，4，7－四氮雜環(huán)十二烷－1，4，7－三乙酸（Eu-HPDO3A）標(biāo)記同源和非同源的骨骼肌成肌細胞（C2C12）并植入C57B6/J小鼠的心肌中，通過CEST預(yù)測這種帶有分化潛能的成肌細胞在心肌梗死模型中的療效。Eu與Gd一樣具有潛在的生物毒性?，F(xiàn)有更多更安全的CEST相關(guān)標(biāo)志物已用于心肌梗死干細胞示蹤研究，如CEST報告基因表達的單純皰疹病毒1型胸苷激酶蛋白[10]（HSV1－TK），以及非金屬 CEST 大分子如賴氨酸蛋白[11]等。

1.3 氧化鐵類對比劑 氧化鐵類對比劑通過直接胞吞、轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)胞吞及電穿孔法等技術(shù)標(biāo)記組織細胞，方法簡單、安全有效。此類對比劑根據(jù)直徑大小分為超微超順磁性氧化鐵（USPIO）、單晶氧化鐵納米復(fù)合物 （monocrystallineiron oxide nanocompound,MION）、超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)，其中SPIO已成功用于心肌梗死診斷[12]。SPIO能引起組織局部磁場不均勻，從而縮短質(zhì)子去相位的弛豫時間，產(chǎn)生負(fù)性T2對比效應(yīng)，而對T1弛豫影響較小，所以觀察SPIO標(biāo)記細胞在體內(nèi)的生物過程應(yīng)選擇T2加權(quán)成像。隨著多種MR技術(shù)的發(fā)展，氧化鐵類對比劑在MR細胞示蹤技術(shù)研究中也將有新的進展。如T2*map序列較傳統(tǒng)T2序列能更敏感地檢測出USPIO標(biāo)記的干細胞[13]，還有基于超短回波時間（ultr ashort TE，U TE）的序列可以進行SPIO的陽性對比成像[14]。

傳統(tǒng)SPIO標(biāo)記干細胞的最佳終質(zhì)量濃度為50 μg/mL[15]，而新型 Molday IONRhodamine-BTMSPIO可低至20μg/mL[16]。除了改變SPIO相關(guān)對比劑的結(jié)構(gòu)本身，若SPIO相關(guān)對比劑能在其周圍形成蛋白冠，所標(biāo)記的干細胞在MR成像示蹤效果會更好[17]，從而克服轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)胞吞SPIO引起納米粒子沉淀等缺點[18]。Khurana等[19]直接靜脈注射SPIO可有效標(biāo)記體內(nèi)間充質(zhì)干細胞，并且能通過MR成像追蹤干細胞移植，該技術(shù)的成功應(yīng)用降低了體外標(biāo)記間充質(zhì)干細胞程序中污染和生物改建的危險[19]，可直接應(yīng)用于臨床；而SPIO對外在磁場較敏感，其在濃度較低時就能使標(biāo)記細胞達到所需的顯影效果。另外，改變標(biāo)記細胞輸送的途徑或許能增加細胞存活率，Gao等[20]發(fā)現(xiàn)通過逆行冠狀靜脈輸注能使SPIO標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞 （m esenchymal stemcel l，M SC）有效存活。MRI不僅能實現(xiàn)標(biāo)記干細胞后的跟蹤，還可以實時監(jiān)控SPIO標(biāo)記干細胞注射，通過不斷調(diào)整注射劑量和方式來保證標(biāo)記后的干細胞到達靶區(qū)[18]。

然而，SPIO雖可成功標(biāo)記干細胞，但其磁性標(biāo)志物會隨著細胞代謝和分裂分化而逐漸消失（即稀釋作用[21]），且隨著T2延長而不能長期有效示蹤細胞。而且SPIO特異性較低，MRI僅能通過因鐵顆粒引起的低信號間接判斷干細胞的存在，卻不能區(qū)分鐵顆粒到底是在干細胞內(nèi)、巨噬細胞內(nèi)還是在細胞間質(zhì)，因此SPIO示蹤法不能反映移植干細胞的存活，檢測到的信號存在假陽性[22]。Ma等[23]發(fā)現(xiàn)MRI無法區(qū)分檢測到的SPIO信號是來自成功定植的干細胞還是吞噬了SPIO的巨噬細胞。為克服SPIO假陽性的局限，近年來對SPIO標(biāo)記干細胞的研究趨向于雙標(biāo)記法，如Ngen等[24]使用釓劑和鐵劑同時標(biāo)記，使活細胞主要為負(fù)性T2/T2*效應(yīng)，在死細胞附近主要產(chǎn)生擴散的陽性T1信號，通過MRI雙對比方法實時成像移植干細胞。Hitchens等[25]研究發(fā)現(xiàn)SPIO和全氟化碳（PFC）試劑均能縮短19F-MRI的T2值，因此存在于巨噬細胞的SPIO在19F-MRI上的信號可通過消除從死細胞轉(zhuǎn)移到巨噬細胞的PFC信號，使得影像上僅為活細胞的PFC產(chǎn)生的信號，從而消除干細胞分布的假陽性影像。但SPIO能被吸收進入人體鐵循環(huán)代謝，而PFC和釓不能為人體代謝，因此這些技術(shù)推廣到臨床應(yīng)用具有一定的難度。

2 MR報告基因成像

MR報告基因成像是通過特定程序重新整合靶細胞的基因，使其穩(wěn)定表達導(dǎo)致MR信號改變的物質(zhì)，如某些受體、酶類（包括變構(gòu)酶）等，該方法不需要外源性對比劑，為間接標(biāo)記成像[26]。由于只有存活的移植干細胞才可以持續(xù)表達改變MR信號的物質(zhì)，因此報告基因成像可以提供心肌梗死治療中移植干細胞的存活狀況[27]。Vandsburger等[28]提出目前主要的報告基因為：①酶相關(guān)報告基因，主要包括肌酸激酶、β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶等報告基因；②受體相關(guān)報告基因，主要包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等報告基因；③CEST相關(guān)報告基因；④其他類型的報告基因。目前在動物實驗中已有幾種經(jīng)過驗證的MR報告基因，包括肌酸激酶、鐵儲存蛋白（如鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）和人工蛋白（如富含賴氨酸的蛋白），可特異性識別存活干細胞并長期示蹤干細胞[29]，其中以過表達鐵蛋白作為MRI報告基因在心肌梗死模型的研究應(yīng)用最多。

2.1 過表達鐵蛋白 細胞內(nèi)的儲存鐵是通過細胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）把細胞外轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵轉(zhuǎn)運到細胞中，再由細胞內(nèi)的鐵蛋白儲存鐵。體內(nèi)鐵蛋白過表達在MRI上產(chǎn)生的對比度不會隨細胞分裂、增殖而減少，與標(biāo)記細胞的氧化鐵納米顆粒所產(chǎn)生的對比度相比，其更加穩(wěn)定。此外，即使在缺血條件下，鐵蛋白過表達細胞始終能積累足夠的鐵，仍能在MRI上產(chǎn)生強烈的R2/R2*對比。

Naumova等[30]最早在心肌梗死模型中采用過表達鐵蛋白的基因作為MR報告基因，將野生型的成骨骼肌細胞（C2C12）和鐵蛋白過度表達基因修飾的C2C12分別移植到對照組和實驗組小鼠的梗死心臟中，移植3周后通過T2*序列檢測，實驗組小鼠的心臟MR影像中可見低信號區(qū)域 （由過度表達的鐵蛋白復(fù)合物中鐵積累引起），而對照組小鼠心臟中未見該區(qū)域有MR信號變化；經(jīng)組織學(xué)證實2組小鼠心臟都有骨骼肌移植物存在，證實了過表達鐵蛋白的干細胞基因修飾技術(shù)能使移植后的干細胞產(chǎn)生足夠的MR對比度，從而使其在體內(nèi)可連續(xù)監(jiān)測。Campan等[31]利用人鐵蛋白重鏈（hFTH）作為報告基因，使干細胞過量表達鐵蛋白，從而使存活的干細胞能在心臟MRI產(chǎn)生信號，實現(xiàn)干細胞示蹤。上述2項研究均發(fā)現(xiàn)鐵蛋白重鏈的過度表達不影響細胞生存和增殖，揭示了使用鐵蛋白過表達的基因作為MRI報告基因的潛力，有利于在MRI上觀察到成功植入且在梗死區(qū)域存活并增殖的干細胞。

2.2 膜結(jié)合受體靶抗原 Chung等[32]通過基因再造使胚胎干細胞表達血凝素酸 （hemagglutinin acid，HA）及myc表面抗原，隨后將USPIO共價結(jié)合于抗HA及myc抗原的單克隆抗體上，將標(biāo)記后的單克隆抗體與HA及myc抗原陽性干細胞共培養(yǎng)5 d后，移植到心肌梗死動物模型中，相應(yīng)移植區(qū)MR信號強度降低，結(jié)合HE染色證實了該MR信號降低區(qū)域為移植干細胞聚集區(qū)。該研究發(fā)現(xiàn)以膜結(jié)合受體靶抗原作為MRI報告基因不僅能解決傳統(tǒng)SPIO特異性低、不能證實移植細胞存活狀況的局限，還能有效克服基于鐵蛋白報告基因成像敏感度低等問題。

2.3 具有多重功能的MRI報告基因 多能干細胞在梗死的心肌區(qū)可分化成為新生心肌細胞，同時還有形成腫瘤性畸胎瘤的風(fēng)險。Neyrinck等[33]不但將人類生長抑素受體2型（human somatostatin receptor type 2，hSSTr2）用作成像報告基因，還將其用作放射性核素治療的自殺機關(guān)，保證多能干細胞衍生細胞治療心肌梗死的安全性。在Liu等[34]研究中，轉(zhuǎn)導(dǎo)酪氨酸酶報告基因的MSC聚集區(qū)域不僅在MRI上有明顯改變，還可在光聲成像、PET的影像上有突出的信號改變，而注射非轉(zhuǎn)導(dǎo)MSC或假手術(shù)的大鼠未見信號，該技術(shù)能通過多種成像手段對酪氨酸酶報告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC進行監(jiān)測，為檢測移植干細胞的活性、分布、定植時間提供了可行且可靠的方法，且與其他外源報告基因相比，酪氨酸酶表現(xiàn)出較低的毒性和較少的免疫反應(yīng)。

MR報告基因成像技術(shù)是MR在基因水平上對靶細胞的示蹤，相對于直接標(biāo)記成像，該技術(shù)更復(fù)雜且要求更嚴(yán)?；蛟僭鞂?biāo)記細胞的生物學(xué)特性的影響、標(biāo)記細胞內(nèi)報告基因產(chǎn)物的蓄積、外源抗原引起的宿主免疫反應(yīng)等這些可能出現(xiàn)的問題都有待更深一步的研究。目前，MR報告基因成像技術(shù)尚處于基礎(chǔ)研究階段，用于臨床研究還有較大距離。

3 總結(jié)與展望

MR分子成像具有無創(chuàng)、信號不受組織深度的限制，可同時提供移植細胞周圍的生理及組織結(jié)構(gòu)信息等特點，但仍面臨許多突出的問題：①稀釋作用：移植干細胞存在不均等分裂的現(xiàn)象[11]，隨著分裂分化標(biāo)志物濃度不斷降低；②標(biāo)志物對細胞的潛在毒性；③標(biāo)記細胞的存活狀態(tài)的特異性顯示等。這些問題的解決需要進一步研究新型更安全、更有效的MR標(biāo)志物。在應(yīng)用MR時還要考慮有外在磁場時活體內(nèi)金屬移植物和對生物體整體的影響。MRI技術(shù)本身也需要提高，除了高場強條件外，更多新序列的研發(fā)會使細胞示蹤的結(jié)果更可靠，如非共振飽和度（off-resonance saturation）序列能使超順磁性鐵對比劑顯示為陽性信號，減少氣泡和偽影的干擾[35]。而MR報告基因成像一定程度上克服了傳統(tǒng)對比劑標(biāo)記細胞成像的低特異性，而且更能指示出真實的新生心肌區(qū)域，但是外源成像基因引入對細胞的安全性等都需要更多的實驗去證實。

總之，目前雖沒有影像技術(shù)完全達到理想要求，但現(xiàn)有的MR細胞示蹤技術(shù)為自體移植干細胞治療的評價提供了一定的依據(jù)和可能。理想的報告基因表達應(yīng)可被誘導(dǎo)型啟動子調(diào)節(jié)，通過最小化報告基因?qū)毎旧碓鲋?、遷移、分化的影響來增加安全性[36]。且由于干細胞具有多向分化潛能，即使分化為其他類型的細胞也同樣會表達改變MR信號的物質(zhì)，而臨床上應(yīng)用需要觀察的只是干細胞分化為心肌細胞的特定部分。只有當(dāng)干細胞向心肌細胞分化才會顯像這一研究成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用才更有價值，因此利用肌動蛋白啟動報告基因表達的MR報告基因成像可能成為今后的研究熱點。隨著研究的不斷深入，應(yīng)用于干細胞移植治療心肌梗死中的MR活體示蹤技術(shù)會有新的突破，促進自體干細胞細胞移植治療更有效、安全地轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用。