堿性蛋白酶和木聚糖酶對玉米-豆粕型日糧干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的體外酶解效果研究

劉蘆鵬，張 邦，田 璐，宋宇朵，劉鑫鑫，馬文鋒

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471023）

酶制劑作為一種安全無污染的活性蛋白分子，因其獨(dú)特的作用效果被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)[1]。仔豬消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟，內(nèi)源蛋白酶分泌不足，斷奶時(shí)仔豬對營養(yǎng)物質(zhì)的攝入方式由母乳轉(zhuǎn)為植物飼糧，導(dǎo)致仔豬對日糧蛋白質(zhì)的利用率較低，嚴(yán)重時(shí)引起消化功能紊亂和營養(yǎng)應(yīng)激反應(yīng)[2-3]。因此，在生產(chǎn)中，可以通過添加外源蛋白酶的方式提高對蛋白質(zhì)的吸收利用[3]。同時(shí)，中國小麥產(chǎn)量較高，具備成為飼料原料的潛力，然而小麥含有大量木聚糖，木聚糖作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，可以增加腸道食糜粘性。因此，在生產(chǎn)中，一般通過補(bǔ)充木聚糖酶以降解木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。

目前，常用體內(nèi)試驗(yàn)（動(dòng)物生產(chǎn)試驗(yàn)）和體外酶解試驗(yàn)評價(jià)酶制劑的作用效果。然而，動(dòng)物群體的個(gè)體差異不容易消除，在進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)需要保證相當(dāng)數(shù)量的動(dòng)物群體才能完成，因此難以同時(shí)評價(jià)多種酶類的作用效果；與體內(nèi)試驗(yàn)法相比，采用透析袋體外酶解法，可以模擬動(dòng)物胃腸道消化吸收的生理特點(diǎn)，該法快速、準(zhǔn)確且重復(fù)性高[4]。本試驗(yàn)在玉米-豆粕型日糧中添加不同濃度的堿性蛋白酶和木聚糖酶，研究其對日糧中干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率以及還原糖生成量的影響，為堿性蛋白酶和木聚糖酶的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 酶制劑 試驗(yàn)所用堿性蛋白酶（活性200 000 U/g）和木聚糖酶（活性100 000 U/g）均為單酶，購自河南仰韶生化工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)日糧 采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置1個(gè)對照組和5個(gè)濃度梯度，每個(gè)添加水平分別設(shè)5個(gè)重復(fù)，其中堿性蛋白酶的濃度為20、40、60、80、100 U/g，木聚糖酶的濃度為10、20、30、40、50 U/g，對照組的試驗(yàn)程序與試驗(yàn)組相同。

試驗(yàn)原料組成參考仔豬常用日糧配制，原料組成及營養(yǎng)成分見表1。利用粉碎機(jī)對混合后的飼料粉碎，至95%以上過60目篩網(wǎng)，置于包裝袋內(nèi)密封，備用。

1.3 胰蛋白酶溶液 稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加入500 mL蒸餾水使其充分溶解，再用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，取胰蛋白酶10 g（Sigma，P7545），加入適量蒸餾水使其溶解，將2種溶液混合后，加蒸餾水定容至1 000 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 試驗(yàn)原料組成和營養(yǎng)成分

1.4 體外酶解操作過程 模擬胃的消化：稱取1 g飼料樣品（精確至0.000 1 g），編號(hào)后置于150 mL 三角瓶中，加入20 mL 鹽酸氯化鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 2.0）和0.1 g的胃蛋白酶（Sigma，P7000），用封口膜封緊瓶口。在厭氧條件下，將三角瓶置于39 恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩6 h，震蕩頻率為70 r/min。

模擬小腸酶解過程：完成胃期模擬消化后，打開封口膜，加入20 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）和2.5 mL配制好的胰蛋白酶溶液。在溶液pH為7.0、厭氧環(huán)境下，封好三角瓶的瓶口，放置于39 的恒溫?fù)u床內(nèi)震蕩24 h，震蕩頻率為70 r/min。

還原糖生成量的測定：24 h后取出，取出三角瓶，室溫靜置20 min，取酶解后上清液1 mL于試管中，加入DNS檢測液2 mL，水浴鍋內(nèi)煮沸5 min，取出，冷卻至室溫，加9 mL蒸餾水，混勻。在540 nm光波處測定各溶液的吸光度值，通過還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中的還原糖含量。還原糖生成量計(jì)算公式：

還原糖生成量（mg/g）=（C×VT）/（m×VS）×1000其中，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線所查糖量（mg），VT為提取液的體積（mL），m為樣品的質(zhì)量（g），VS為測定時(shí)的溶液體積（mL）。

干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的測定：使用絕干稱重的濾紙對三角瓶中的酶解殘?jiān)婵粘闉V，將抽濾后的殘?jiān)蜑V紙置于105 烘箱中烘干至恒重，使用半自動(dòng)定氮儀測定粗蛋白質(zhì)含量。干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解率的計(jì)算公式：

其中，M0為飼料樣品干物質(zhì)重量（g），M1為未酶解殘?jiān)晌镔|(zhì)重量（g），CP0為飼料樣品粗蛋白質(zhì)含量（%），CP1為未酶解殘?jiān)值鞍踪|(zhì)含量（%）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 以試驗(yàn)重復(fù)為單位，采用SAS（2001）中GLM模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過線性（Linear）和二次（Quadratic）效應(yīng)評估不同濃度堿性蛋白酶和木聚糖酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的影響，處理間顯著性判定水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)以最小二乘均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加堿性蛋白酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的影響 由表2可知，日糧中添加堿性蛋白酶可以顯著提高還原糖生成量（二次，P＜0.05）和干物質(zhì)酶解效率（二次，P＜0.05）。當(dāng)堿性蛋白酶添加量為60 U/g時(shí)，日糧中的還原糖生成量最高；當(dāng)堿性蛋白酶添加量為80 U/g時(shí)，干物質(zhì)酶解效率最高。

根據(jù)體外酶解試驗(yàn)結(jié)果建立還原糖和干物質(zhì)酶解率（Y）與堿性蛋白酶的添加濃度（X）的回歸方程。根據(jù)干物質(zhì)酶解率的二次方程Y=-0.001X2+0.13X+26.99（R2=0.87，P=0.01）得出：當(dāng)?shù)鞍酌傅奶砑恿繛?5 U/g時(shí)，日糧中干物質(zhì)酶解率最高，為31.22%；根據(jù)還原糖的生成量的二次方程 Y=-0.005X2+0.52X+32.88（R2=0.79，P=0.001）得出：當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繛?2 U/g時(shí)，日糧中還原糖生成量最高，為46.4 mg/g。

2.2 添加木聚糖酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解率的影響 由表3可知，日糧添加木聚糖酶可以顯著提高干物質(zhì)酶解率（二次，P＜0.05），但對還原糖生成量和粗蛋白質(zhì)酶解率無顯著影響。當(dāng)木聚糖酶添加量為20 U/g時(shí)，日糧中的干物質(zhì)酶解率最高。

表2 堿性蛋白酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解率的影響

表3 木聚糖酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解率的影響

根據(jù)體外酶解試驗(yàn)結(jié)果建立干物質(zhì)酶解率（Y）與木聚糖酶添加量（X）的回歸方程。根據(jù)干物質(zhì)酶解率的二次方程 Y=-0.006X2+0.40X+59.62（R2=0.72，P=0.002）得出：當(dāng)木聚糖酶添加量為33 U /g時(shí)，日糧中干物質(zhì)酶解率最高，為66.29%。

3 討 論

本試驗(yàn)選用的蛋白酶為堿性蛋白酶，由于其活性中心含絲氨酸，又稱絲氨酸蛋白酶，它由一條多肽鏈構(gòu)成，最適pH在9～11，其在pH 6～10比較穩(wěn)定，pH低于6或大于11時(shí)很快失活。目前，利用基因工程手段定向改造蛋白酶已成為研究熱點(diǎn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶不僅可以去除一些抗?fàn)I養(yǎng)因子[6]，同時(shí)可以補(bǔ)充幼齡動(dòng)物內(nèi)源酶，因此作為飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)中。本試驗(yàn)選用的蛋白酶主要通過芽胞桿菌液態(tài)發(fā)酵獲得，在生產(chǎn)過程中保留了少量的纖維素酶和半纖維素酶活性，因此本試驗(yàn)中蛋白酶不僅可以提高日糧的干物質(zhì)酶解效率，也提高了還原糖生成量，表明添加蛋白酶可以在一定程度上提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率。

含小麥、稻谷和麩皮等飼料中的木聚糖含量較高，其降解需要木聚糖水解酶協(xié)同完成，其中木聚糖酶是最為關(guān)鍵的水解酶[7]。添加木聚糖酶可以有效釋放細(xì)胞成分、降解木聚糖為小分子糖、降低動(dòng)物腸道內(nèi)容物的粘性、提高營養(yǎng)成分的消化率。葉楠等[8]研究發(fā)現(xiàn)，添加木聚糖酶可以改善斷奶仔豬的生長性能，還可以改善腸道微生態(tài)環(huán)境，其作用效果與飼糧中木聚糖含量存在劑量關(guān)系。胡向東等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小麥在日糧中的添加比例達(dá)到40%時(shí)會(huì)對生長豬的生長性能產(chǎn)生負(fù)面影響，而在此基礎(chǔ)上添加200 U/kg木聚糖酶后，生長豬的平均日增重和飼料增重明顯改善，同時(shí)調(diào)節(jié)生長豬腸道菌群，降低氮的排放。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加木聚糖酶可以提高還原糖生成量，說明木聚糖酶的添加可以釋放含小麥日糧中一定數(shù)量的單糖，因此具有潛在的營養(yǎng)價(jià)值。

在進(jìn)行飼用酶評估時(shí)，由于體內(nèi)試驗(yàn)的復(fù)雜性，在面對飼用酶相互篩選與配伍時(shí)，不僅工作量較大，也存在很高的變異系數(shù)。近年來，體外模擬酶解法得到普及和應(yīng)用，為快速、高效評價(jià)酶制劑提供了新思路[10]。體外模擬酶解法可以建立以“三角瓶+胃腸pH+搖床”為基礎(chǔ)的反應(yīng)手段，設(shè)置對照飼糧組和酶制劑+飼糧組，此方法可以直接反映酶制劑對不同底物的酶解效果。也有研究認(rèn)為，在進(jìn)行體外酶解評價(jià)時(shí)，可以分別設(shè)置胃蛋白酶和胰蛋白酶的“兩步法”試驗(yàn)程序，此方法可以更加合理地模擬動(dòng)物體內(nèi)酶解狀態(tài)[10]。因此，本試驗(yàn)的對照組和試驗(yàn)組均采用“兩步法”體外酶解程序進(jìn)行研究，旨在研究在胃蛋白酶（模擬胃的酶解）和胰蛋白酶（模擬小腸酶解）的基礎(chǔ)上添加外源酶制劑對飼糧營養(yǎng)物質(zhì)利用率進(jìn)一步的改善效率。

目前，相關(guān)試驗(yàn)已研究外源補(bǔ)充酶制劑對日糧營養(yǎng)組分的影響[11-13]。Bedford等[14]采用胃蛋白酶-胰液素體外兩步法，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶的添加劑量與食糜粘度存在較好的相關(guān)性；高理想等[15]通過體外酶解法篩選出了纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果膠酶在生豬不同日糧類型的最佳酶譜，優(yōu)化后的酶譜分別使玉米-豆粕型和玉米-雜粕型日糧的體外干物質(zhì)酶解率提高了3.26%和3.75%，顯示酶制劑的作用效果與日糧底物關(guān)系密切。然而，體外試驗(yàn)畢竟不能完全模擬動(dòng)物復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，酶制劑的作用效果也會(huì)受到動(dòng)物種類及生長階段的影響[16]，如何優(yōu)化體外試驗(yàn)方法，使其更加貼近動(dòng)物的實(shí)際消化特點(diǎn)，相關(guān)技術(shù)參數(shù)有必要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

堿性蛋白酶添加濃度由20 U/g提高至100 U/g時(shí)，顯著提高日糧的還原糖生成量和干物質(zhì)酶解率；木聚糖酶添加濃度由10 U/g提高至50 U/g時(shí)，顯著提高日糧的干物質(zhì)酶解率。以干物質(zhì)為評價(jià)指標(biāo)時(shí)，堿性蛋白酶和木聚糖酶在本試驗(yàn)中玉米-豆粕日糧的體外適宜添加濃度分別為65 U/g和33 U/g。