孫施杰,王 羽中,茅慧玲
(浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,浙江臨安 311300)
早期斷奶可促進(jìn)羔羊瘤胃發(fā)育、滿足補(bǔ)償性生長(zhǎng)以及提高母羊的繁殖率等[1-2]。然而早期斷奶時(shí)羔羊易出現(xiàn)“應(yīng)激綜合征”,尤其是胃腸道的氧化應(yīng)激會(huì)使羔羊出現(xiàn)“生長(zhǎng)性休克”或負(fù)增長(zhǎng),導(dǎo)致成活率和育成率降低。亮氨酸作為動(dòng)物的必需氨基酸,除參與哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)合成和骨骼肌蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)、腸道發(fā)育調(diào)節(jié)外[3-5],還是一種有效的抗氧化物質(zhì),可以有效緩解氧化應(yīng)激,維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的平衡[6]。胡軍等[7]研究報(bào)道,添加亮氨酸可以降低早期斷奶仔豬腸道的活性氧水平。因此推測(cè),新生羔羊補(bǔ)飼亮氨酸可促進(jìn)瘤胃的早期發(fā)育,促進(jìn)瘤胃微生物區(qū)系的建立,減緩早期斷奶應(yīng)激引起的氧化損傷,從而提高生產(chǎn)性能。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)探討亮氨酸對(duì)早期斷奶湖羊羔羊瘤胃細(xì)菌菌群組成以及瘤胃發(fā)酵的影響,從瘤胃微生物角度研究亮氨酸對(duì)瘤胃發(fā)育影響的可能機(jī)制。
1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取出生5 d 健康無(wú)疾病的湖羊羔羊36只,根據(jù)體重、出生日期相同或相近的原則,按照亮氨酸的添加量不同隨機(jī)分為對(duì)照組(C,0 g/d)、低劑量添加組(L,0.66 g/d)和高劑量添加組(H,1.33 g/d),每組4 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)3 只羔羊。羔羊飼喂代乳粉,每天飼喂3 次,自由采食;經(jīng)5 d 適應(yīng)環(huán)境和代乳粉后,于10 日齡開始正式試驗(yàn),飼喂代乳粉的同時(shí)補(bǔ)喂開食料及羊草。代乳粉的飼喂量為每天780 mL/ 只(根據(jù)適應(yīng)期代乳粉的采食量確定),為促進(jìn)開食料和羊草的采食,代乳粉每天減少30 mL/ 只至210 mL/ 只時(shí),維持此飼喂量不變直至30 日齡斷奶。亮氨酸溶解在70 mL代乳粉中,于每天晨飼時(shí)通過(guò)灌喂的方式添加1次。
羔羊在30 日齡斷奶當(dāng)天,根據(jù)平均體重和平均日采食量每個(gè)重復(fù)取1 只羔羊進(jìn)行屠宰。在瘤胃顱腹囊的中心采集1 m3左右的瘤胃組織樣品,保存在30% 的福爾馬林溶液中。瘤胃內(nèi)容物部分保存于-20 ,用于測(cè)定瘤胃發(fā)酵參數(shù),另一部分保存于-80 ,用于提取DNA,測(cè)定瘤胃細(xì)菌的多樣性。
表1 代乳粉、開食料及羊草營(yíng)養(yǎng)成分① %
1.2 試驗(yàn)日糧 試驗(yàn)日糧由代乳粉、開食料(杭州思我特農(nóng)業(yè)科技有限公司)和羊草組成,其營(yíng)養(yǎng)成分見表1。
1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法
1.3.1 瘤胃組織形態(tài) 瘤胃組織樣品采用酒精脫水(50%、70%、80%、95%、100% 酒精脫水30 min,100% 酒精脫水15 min),脫水后組織轉(zhuǎn)移至二甲苯透明2 h 后石蠟包埋,切成5 μm 厚的切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法。光學(xué)顯微鏡(Leica,美國(guó))下的每張切片隨機(jī)選10 個(gè)典型視野,使用Motic Image Plus 2.0 軟件(廈門,中國(guó))測(cè)定瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度。
1.3.2 瘤胃發(fā)酵參數(shù) 揮發(fā)性脂肪酸(VFA):采用氣相色譜法測(cè)定瘤胃內(nèi)容物VFA 濃度。取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無(wú)菌PBS 中震蕩懸浮洗滌,13 000×g 4 離心15 min,取上清液,每1 mL VFA 樣品中加入20 μL 85%~90% 正磷酸,按照上述方法再次離心,取上清液,采用氣相色譜(GC-8A;島津公司,京都,日本)測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸的濃度,進(jìn)樣量為2 μL,注射器/ 檢測(cè)器的溫度為260 ,柱溫為220 ,載氣為高純氮[8]。
氨態(tài)氮(NH3-N)濃度:取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無(wú)菌PBS 中震蕩懸浮洗滌,取5 mL 于3 500~4 000 r/min 離心10 min,取上清,采用馮宗慈等[9]方法,使用氯化銨作為標(biāo)準(zhǔn)品,用酶標(biāo)儀測(cè)定700 nm 波長(zhǎng)條件下上清中NH3-N 濃度。
微生物蛋白:取約2 g 瘤胃內(nèi)容物置于10 mL 無(wú)菌PBS中震蕩懸浮洗滌,取8 mL,4 20 000×g 離心20 min,去上清。采用嘌呤法,以酵母RNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品,使用紫外分光光度計(jì)(Beckman,DU 640)測(cè)定在260 nm波長(zhǎng)條件下微生物蛋白含量。
1.3.3 瘤胃細(xì)菌多樣性
1.3.3.1 DNA 提 取 參 照 Gagen 等[10]的 珠 磨 法 提 取DNA。所有DNA樣品用Qubit2.0(Invitrogen)測(cè)定濃度。
1.3.3.2 細(xì)菌16S rRNA 基因序列擴(kuò)增 16S rRNA 基因序列擴(kuò)增采用341F/806R 通用引物[11]:上游為5'-ACTCCTA CGGGRSGCAGCAG-3';下游為 5'-GGACTACVVGGGTA TCTAATC-3'。為區(qū)分每個(gè)不同的樣本,在通用引物的上游序列中隨機(jī)添加8 個(gè)核苷酸堿基的序列標(biāo)簽,即Barcoded-tag,形成Barcoded 融合引物。PCR 反應(yīng)條件:95 預(yù)變性 5 min;95 變性 40 s,55 退火 40 s,72 延伸 1 min,共 30 循環(huán);72 延伸 7 min。
1.3.3.3 Illumina HiSeq 測(cè)序及下機(jī)數(shù)據(jù)分析 Illumina-HiSeq 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析委托上海銳翌生物科技有限公司完成。測(cè)序后首先對(duì)原始數(shù)據(jù)拼接(PANDAseq 軟件)和質(zhì)控(去除平均質(zhì)量低于20 的reads,去除reads含N 堿基數(shù)超過(guò)3 個(gè)的reads)得到Clean reads;采用Usearch軟件在97% 相似度下進(jìn)行聚類以及嵌合體過(guò)濾從而得到OTU;對(duì)每個(gè)樣品的Reads 進(jìn)行隨機(jī)抽平處理,并提取對(duì)應(yīng)的OTU 序列;采用Qiime 軟件做Alpha 多樣性指數(shù)的稀釋曲線,根據(jù)稀釋曲線選擇合理的抽平參數(shù);從Qiime 軟件分析抽平后的OTU 中分別提取1條Read 作為代表序列,使用RDP 方法,將該代表序列與16S 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),對(duì)每個(gè)OTU 進(jìn)行物種分類;歸類后,根據(jù)每個(gè)OTU 中序列的條數(shù),得到OTU 豐度表,最后根據(jù)該OTU 豐度表進(jìn)行后續(xù)分析。微生物各門屬和OTU 需在每個(gè)處理組的至少3 只羔羊中出現(xiàn)。
1.4 統(tǒng)計(jì)分析 用SAS 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,正交多項(xiàng)式比較不同水平亮氨酸的作用(線性或二次),差異顯著時(shí)用Duncan's 作多重比較。以P≤0.01 表示為差異極顯著,P≤0.05 表示為差異顯著,以 0.05<P≤0.10 表示差異有趨勢(shì)。
2.1 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃組織形態(tài)的影響 由圖1 可見,日糧添加亮氨酸可以增加羔羊瘤胃乳頭的長(zhǎng)度。由表2 可見,瘤胃乳頭長(zhǎng)度隨著亮氨酸添加量的增加而增加,且在C 組與H 組達(dá)顯著水平(線性,P<0.01);添加亮氨酸可使瘤胃乳頭寬度有增加趨勢(shì),但3 組間無(wú)顯著差異(線性,P>0.05)。
2.2 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表2 可見,亮氨酸可使瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)水平顯著提高(二次,P=0.05),但未改變乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比例(P>0.05)。與C 組相比,L 與H 組的瘤胃NH3-N 濃度均顯著降低(線性,P<0.05;二次,P>0.05), 分別降低 43.0% 和 36.7%, 且 L 組羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物蛋白濃度顯著高于C 組(二次,P=0.05)。
2.3 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃微生物多樣性的影響
表2 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃組織發(fā)育及發(fā)酵參數(shù)的影響
2.3.1 微生物多樣性分析 下機(jī)序列經(jīng)拼接、優(yōu)化、質(zhì)控后共得到566 213 條優(yōu)質(zhì)序列,平均每個(gè)樣品47 184條(±4 391 條)。共獲得343 個(gè)OTU,平均每個(gè)樣品148 個(gè)(±22 個(gè))。樣品稀釋曲線如圖2 所示,Good's coverage 在0.99 以上,因此,本試驗(yàn)測(cè)序深度能夠準(zhǔn)確反映湖羊瘤胃微生物組成。
由表3 可見,3 組羔羊瘤胃內(nèi)容物的OTU 個(gè)數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。
由圖 3 可見,3 組 OTU 數(shù)共有 164 個(gè),C、L 和H組特有的OTU 數(shù)分別為24、29、43 個(gè)。
2.3.2 添加亮氨酸對(duì)羔羊瘤胃物種分類的影響 瘤胃細(xì)菌門分類圖顯示(圖4),瘤胃內(nèi)細(xì)菌主要?dú)w于厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria) 和變形菌門(Proteobacteria)四大類。3 個(gè)處理組瘤胃內(nèi)微生物種類存在差異(表4),L 組瘤胃內(nèi)最多的是厚壁菌門(49.5%),H 組擬桿菌門(51.4%)顯著高于L、C 組(二次,P=0.05)。
表3 97%相似性水平下物種豐富度和多樣性指數(shù)
表4 羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物門水平(>0.1%)相對(duì)豐度
由表5 可知,各組均以普雷沃氏菌屬、歐陸森氏菌屬、小桿菌屬和瘤胃球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬,且普雷沃氏菌占比例最多。H 組的普雷沃氏菌屬最多,達(dá)41.4%;與C 組相比,L 組的雙歧桿菌屬( 二次,P<0.05)、光崗菌屬(二次,P<0.05)和巨型球菌屬顯著增加(二次,P<0.01);梭菌屬隨著亮氨酸的添加而降低,且在C 組與H 組達(dá)顯著水平(線性,P<0.05)。各組間歐陸森氏菌屬、擬桿菌屬、纖維桿菌屬、小桿菌屬、瘤胃球菌屬、琥珀酸菌屬等相對(duì)含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。
瘤胃上皮約有25 萬(wàn)個(gè)瘤胃乳頭,可使黏膜表面積擴(kuò)大6~7 倍,從而通過(guò)增加瘤胃上皮與瘤胃內(nèi)容物的接觸面積來(lái)增加瘤胃上皮對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和離子轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。因此可通過(guò)瘤胃乳頭的發(fā)育狀況(長(zhǎng)度和寬度)來(lái)衡量瘤胃發(fā)育狀況[13],而瘤胃微生物發(fā)酵固體飼料產(chǎn)生的VFA 是刺激瘤胃乳頭發(fā)育的主要原因[14]。本研究顯示,添加亮氨酸雖然對(duì)乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比沒(méi)有影響,但可顯著增加TVFA 濃度,這部分結(jié)果與添加亮氨酸增加瘤胃乳頭長(zhǎng)度的結(jié)果較為一致。亮氨酸增加TVFA 的主要原因與開食料采食量(123 g/d vs131 g/d vs 95.2 g/d,未發(fā)表數(shù)據(jù))的變化有關(guān)。另一方面,L組羔羊消化道和瘤胃的重量與C 組相比分別提高47.4%和38.6%(未發(fā)表數(shù)據(jù)),表明添加適量亮氨酸可促進(jìn)羔羊消化道和瘤胃的發(fā)育,有利于營(yíng)養(yǎng)吸收。
表5 羔羊瘤胃內(nèi)容物中微生物屬水平(> 0.1%)相對(duì)豐度
瘤胃液中的NH3-N 是瘤胃氮代謝過(guò)程中內(nèi)源含氮物質(zhì)和外源蛋白質(zhì)降解的重要產(chǎn)物,同時(shí)也是瘤胃微生物合成微生物蛋白的主要原料。一般情況下,瘤胃NH3-N 水平呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),但影響瘤胃NH3-N濃度的因素較多,主要包括飼料蛋白的降解程度、氮的攝入量、瘤胃對(duì)NH3-N 的吸收以及瘤胃微生物合成微生物蛋白的速度。本研究發(fā)現(xiàn),添加亮氨酸可以降低瘤胃NH3-N 濃度,增加瘤胃微生物蛋白含量。推測(cè)可能的原因是亮氨酸作為一種氨基酸可以促進(jìn)瘤胃內(nèi)蛋白分解菌的生長(zhǎng),從而提高瘤胃細(xì)菌對(duì)含氮物質(zhì)的降解,提高菌體蛋白合成的底物水平,最終增加瘤胃微生物蛋白的含量。后續(xù)可通過(guò)測(cè)定瘤胃蛋白分解菌的變化驗(yàn)證這一推論。
腸道菌群主要由厚壁菌門(35%~80%)和擬桿菌門(17%~60%)構(gòu)成[15]。本試驗(yàn)中厚壁菌門和擬桿菌門是各組羔羊瘤胃細(xì)菌豐度最高的菌群,與前人的研究結(jié)果較為一致。普雷沃氏菌屬是瘤胃內(nèi)容物中豐度最高的菌屬[16],該菌屬是含有豐富高效的水解淀粉和蛋白質(zhì)的菌種[17]。雙歧桿菌屬是糖類分解菌[18],尤其在飼喂高淀粉日糧的瘤胃中大量存在。因此,普雷沃氏菌屬和雙歧桿菌屬相對(duì)豐度變化受采食量的影響較大,然而L組普雷沃氏菌屬豐度較H 組顯著降低,這一結(jié)果與固體開食料采食量呈相反趨勢(shì),說(shuō)明在本試驗(yàn)中亮氨酸對(duì)普雷沃氏菌屬豐度的影響并非取決于飼料的攝入量,具體的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。巨型球菌屬中的埃氏巨型球菌是瘤胃中提供支鏈VFA 的重要來(lái)源[19]。有研究發(fā)現(xiàn),在新生奶牛日糧中補(bǔ)飼埃氏巨型球菌NCIMB41125 能夠提高犢牛的生長(zhǎng)性能,增加瘤胃內(nèi)丁酸濃度、瘤胃上皮乳頭寬度和密度,表明埃氏巨型球菌NCIMB41125 能通過(guò)促進(jìn)瘤胃代謝、增加代謝產(chǎn)物的吸收來(lái)促進(jìn)瘤胃的發(fā)育[20]。因此,瘤胃埃氏球菌屬相對(duì)豐度的增加在瘤胃發(fā)育中可能起重要作用。光崗菌屬具有很強(qiáng)的發(fā)酵碳水化合物的能力[21],其終產(chǎn)物是乙酸和琥珀酸。添加低劑量的亮氨酸可以增加該菌屬的豐度,但是高劑量反而沒(méi)有顯著影響,原因還有待進(jìn)一步研究。
本試驗(yàn)中,灌喂亮氨酸對(duì)早期斷奶羔羊的瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性沒(méi)有影響,但可以改變細(xì)菌組成(如瘤胃埃氏球菌屬和光崗菌屬的相對(duì)豐度增加),從而影響瘤胃發(fā)酵,增加羔羊瘤胃TVFA 含量,降低NH3-N 濃度,提高微生物蛋白濃度,促進(jìn)瘤胃的發(fā)育,減少斷奶應(yīng)激,且亮氨酸添加量以0.66 g/d 效果更為顯著。