豬精液4 低溫保存技術(shù)研究

崔茂盛，劉 鑫,，張 丹，唐佩娟，穆淑琴，張學(xué)煒，李千軍*

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300380；3.天津市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，天津 300402；4.天津市畜牧總站，天津 300402）

精液保存技術(shù)可以延長(zhǎng)精子貯存時(shí)間并維持受精能力，擴(kuò)大精液使用范圍，提升種公畜利用價(jià)值。與冷凍精液相比，液態(tài)保存精液人工授精后具有受胎率高、窩產(chǎn)仔數(shù)高、費(fèi)用低、操作程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[1]。研究指出，豬精液低溫保存過(guò)程中精子代謝活動(dòng)降低、能量利用減少，有利于延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間[2]。如果4 保存技術(shù)能進(jìn)一步擴(kuò)大豬精液利用效率，便可提高養(yǎng)豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益[3]，而且4 冰箱條件比17 恒溫箱條件更易獲得。然而，由于物種差異性，豬精子的低溫耐受力較差、溫差變化敏感。低溫保存過(guò)程中質(zhì)膜易受到損傷，產(chǎn)生一系列不利影響，妨礙了豬精液4 保存技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用推廣[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)篩選開(kāi)發(fā)4 豬精液保存稀釋劑，旨在為今后豬精液生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 精液來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)所用精液采自天津市天泰星火豬人工授精服務(wù)中心3頭健康、年齡在2～4歲的大白種公豬，采用常規(guī)手握法采精，收集富含精液部分，濾紙過(guò)濾于保溫瓶中，采精室備用，控制原精活率0.8以上，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：果糖、大豆卵磷脂（上海源葉生物科技有限公司），葡萄糖（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），青霉素、鏈霉素（山東魯抗舍里樂(lè)藥品有限公司），碳酸氫鈉、EDTA等（Sigma中國(guó)有限公司）。主要儀器設(shè)備：CASA計(jì)算機(jī)自動(dòng)輔助分析系統(tǒng)（福州鴻視野軟件技術(shù)有限公司）、相差顯微鏡（蔡司ZEISS）、冰箱（河南新飛電器有限公司）、電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

1.3 低溫稀釋液的配制 在徐振軍等[4]的實(shí)驗(yàn)配方基礎(chǔ)上，低溫I號(hào)添加0.02 g果糖、0.125 g碳酸氫鈉、0.075 g大豆卵磷脂；低溫Ⅱ號(hào)添加0.05 g果糖、0.125 g碳酸氫鈉、0.037 5 g大豆卵磷脂、0.125 g EDTA；對(duì)照組為市場(chǎng)占有率高、性能穩(wěn)定、能耐受4 低溫的某品牌長(zhǎng)效稀釋劑。

1.4 精液稀釋與平衡 稀釋：原精取回采精室，遮光放置，測(cè)量原精和稀釋劑溫度，溫差控制1 以內(nèi)。將稀釋劑（低溫I號(hào)、低溫Ⅱ號(hào)，對(duì)照組）按3:1的比例緩慢倒入原精中，稀釋期間輕輕搖晃均勻。

平衡：室溫條件下，稀釋精液分裝到已滅菌的80 mL精液瓶中，遮光放置0.5 h；之后用4層毛巾包裹放入泡沫箱中，置于l7 恒溫箱降溫2.5 h以上，然后泡沫箱移入4 冰箱中保存，每隔24 h取樣檢測(cè)1次。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)分為2部分：第1部分實(shí)驗(yàn)分3組，將采集的大白種豬精液平均分成3份，以成品稀釋劑為對(duì)照組，設(shè)置低溫I號(hào)和低溫Ⅱ號(hào)2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每隔24 h檢測(cè)1次精子活力、質(zhì)膜完整性和精液pH，重復(fù)3次；第2部分實(shí)驗(yàn)分9組，采集大白、長(zhǎng)白和杜洛克種豬精液分別設(shè)置對(duì)照組和低溫I號(hào)、低溫Ⅱ號(hào)實(shí)驗(yàn)組，每隔24 h檢測(cè)1次精子活力，記錄保存時(shí)間，重復(fù)3次。

1.6 精子質(zhì)量檢測(cè) 精子質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)為活力、質(zhì)膜完整性[4]、pH和精子存活時(shí)間。精子存活時(shí)間包括總存活時(shí)間和有效保存時(shí)間，總存活時(shí)間為精子全部死亡時(shí)的保存時(shí)間，有效存活時(shí)間為精子活力保持0.6以上時(shí)的保存時(shí)間。活力、質(zhì)膜完整性及pH檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[4]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 各組數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行前期處理，用SPSS17.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA方差分析，并進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢測(cè)誤差為5%和1%。

2 結(jié)果分析

2.1 大白豬精子在4 保存過(guò)程中的活力變化 由表1可知，在精液4 保存的前2 d，各組精子活力差異不顯著（P＞0.05）。而保存至第6天，低溫I號(hào)和低溫Ⅱ號(hào)的精子活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)中，低溫I號(hào)和低溫Ⅱ號(hào)均能有效保存精子10 d以上。

2.2 大白豬精液4 保存過(guò)程中pH的變化 由表2可知，低溫I號(hào)和低溫Ⅱ號(hào)組豬精液4 保存過(guò)程中pH具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)第1天3組精子稀釋液的pH差異不顯著（P＞0.05），第7天和第10天時(shí)對(duì)照組pH顯著低于2個(gè)實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），保存到第14天時(shí)低低溫I號(hào)和低溫Ⅱ號(hào)組的pH差異顯著（P＜0.05）（對(duì)照組第10天精子已拋棄，所以無(wú)第14天檢測(cè)結(jié)果）。

表1 不同保存劑對(duì)精液保存精子活力的影響 %

表2 不同保存劑對(duì)精液pH的影響

2.3 大白豬精液4 保存過(guò)程中精子的質(zhì)膜完整性 由表3可知，保存第5天、第10天，實(shí)驗(yàn)組中精子質(zhì)膜完整性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 不同保存劑對(duì)精子質(zhì)膜完整性的影響 %

2.4 不同品種豬精子在4 保存過(guò)程中的有效保存和總存活時(shí)間 由表4可知，無(wú)論大白、長(zhǎng)白還是杜洛克種豬，低溫I號(hào)和低溫Ⅱ號(hào)組精液有效保存時(shí)間和總存活時(shí)間均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；其中，在長(zhǎng)白種豬精液的有效保存時(shí)間以及杜洛克、大白種豬精液的總存活時(shí)間上，低溫I號(hào)顯著高于低溫Ⅱ號(hào)（P＜0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)表明，在4 低溫保存過(guò)程中，不同稀釋劑對(duì)精子保護(hù)效果差異較大，而且不同品種的保存效果存在較大差異。這與之前研究報(bào)道中不同公豬本身精液質(zhì)量具有較大差異的結(jié)論較為一致[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，課題組研發(fā)的低溫I號(hào)、Ⅱ號(hào)豬精液低溫保存劑對(duì)豬精子具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，無(wú)論在有效保存時(shí)間、總保存時(shí)間，還是在精子質(zhì)膜完整率等指標(biāo)上均顯著優(yōu)于對(duì)照組，這可能與稀釋劑中添加大豆卵磷脂有關(guān)，研究表明，大豆卵磷脂有較好的低溫抗性對(duì)質(zhì)膜有一定保護(hù)作用[6]。在豬精液4 保存過(guò)程中，大多研究者采用卵黃作為低溫保護(hù)劑，但卵黃制作過(guò)程復(fù)雜而且容易引入病菌[7]。本實(shí)驗(yàn)添加的大豆卵磷脂為植物性成分，能有效降低細(xì)菌病毒的污染，且具有較好的質(zhì)膜保護(hù)作用。此外，本實(shí)驗(yàn)還表明，低溫I號(hào)和Ⅱ號(hào)在精子4 保存過(guò)程中pH變化較緩慢且均勻，能有效避免精子在長(zhǎng)時(shí)間保存過(guò)程中由于酸中毒而死亡，這也可能是實(shí)驗(yàn)組具有較好精子4 保護(hù)能力的原因之一。

表4 不同保存劑對(duì)不同品種豬精子保存時(shí)間的影響