醫(yī)學3D打印技術在視網膜修復的研究進展

謝雨杉，汪艷芳 ，黃文華，2

1.南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖國家重點學科，廣東廣州510515；2.廣東省醫(yī)學3D打印應用轉化工程技術研究中心，廣東廣州510515

前言

視網膜損傷和退行性病變是引起嚴重視力損傷甚至失明的重要原因［1］。如何修復受損的視網膜是臨床治療中長期存在的一大難題。視網膜細胞移植及促細胞生長的相關因子注射是很有潛力的治療手段，但如何獲得安全有效、數(shù)量可觀的移植供體并實現(xiàn)移植后的細胞存活、整合，仍是我們亟需解決的問題。近年來，隨著3D生物打印技術的發(fā)展，皮膚、骨組織紛紛被打印出來并成功移植，3D生物打印技術在組織工程的應用方面展現(xiàn)了極大的優(yōu)勢［2］。許多相關領域的研究者們也對視網膜的3D生物打印做了不同嘗試，在不同類型的視網膜細胞領域取得了不錯的進展。本文將回顧現(xiàn)有階段所采用的生物打印技術及其各類型視網膜細胞生物打印的進度，從而為今后創(chuàng)造可用于治療、可打印的功能性類視網膜組織器官提供指導和建議。

1 生物3D打印

1.1 打印技術

目前主要的生物3D打印技術有噴墨3D打印技術、微擠壓印刷技術、激光輔助打印技術等。

1.1.1 噴墨3D打印技術 噴墨3D打印技術是一種數(shù)字模型文件為基礎，運用粉末狀金屬或塑料等可粘合材料，通過逐層堆疊累積的方式來構造物體的技術（即“積層造形法”）［3］。過去其常在模具制造、工業(yè)設計等領域被用于制造模型，現(xiàn)正逐漸用于一些產品的直接制造，現(xiàn)在可以利用患者的細胞作為原材料打印功能齊全的器官。和之前的噴墨打印機一樣，將培養(yǎng)的生物墨水一層層堆積。噴墨生物3D打印有兩種常見的方式：連續(xù)噴墨印刷和按需滴墨噴墨印刷［4］。雖然噴墨打印可以提高沉積材料的吞吐量，但由于噴嘴存在一些缺陷，很難打印出高濃度的液體（超過1 000萬個細胞/mL），同時由于噴嘴附近的剪切壓力［5］，造成細胞損傷的風險增加［6］。

1.1.2 微擠壓印刷技術 微擠壓印刷技術是一種相對低成本和快速的方法，可以打印高度濃縮的細胞懸液［7］。使用加熱器將熱熔性材料熔化，材料先抽拉成絲狀，通過送絲裝置送進熱熔噴頭，材料在噴頭內加熱融化，噴頭沿零件截面輪廓和填充軌跡運動，同時按照CAD分層數(shù)據的路徑控制半流動狀態(tài)的材料，擠出并沉積在指定的位置凝固成形，并與周圍的材料粘結，層層堆積成型。由于其在打印過程中需要加熱，與噴墨打印相比，細胞的生存能力更低［8］。

1.1.3 激光輔助打印技術 激光輔助打印是一種最昂貴的方法，它在保持細胞生存能力的同時增加了打印過程中細胞的濃度，但速度相對較慢，而且細胞植入的精度難以保證［9］。激光輔助生物打印可分為兩個類別：一是激光導致局部射流形成的細胞打?。欢沁^程涉及光聚合的成型技術。前者使用激光對生物墨水進行局部加熱，形成高壓氣泡，導致射流形成。激光輔助生物打印的分辨率受到許多因素的影響，如激光能量密度、表面密度、基底濕度、基底和吸收層氣隙以及生物樣品層的厚度和黏度等。因此激光輔助打印技術速度相對較慢，而且細胞植入的精度難以保證。

1.1.4 靜電紡絲 靜電紡絲技術是指聚合物溶液或者熔體在高壓靜電場作用下形成纖維的過程，是一種簡單、快捷，且可以較大規(guī)模制備均勻、連續(xù)的一堆納米結構材料的方法，其制備的纖維直徑可從幾十個納米到幾微米，可以對人造肌肉、神經、血管等復雜的人體組織器官進行模擬。影響靜電紡絲的因素有很多，包括紡絲溶液的固有性質（例如聚合物種類、聚合物分子鏈結構、溶液的濃度和粘度、溶液的導電性、溶劑的極性和表面張力情況等）、紡絲條件（例如電場強度、紡絲距離、聚合物溶液的擠出速度等）［10］。

1.2 支架結構生物材料

為了改進打印過程中，細胞懸液濃度難以控制的問題，可以用非細胞水凝膠來打印三維支架，之后在支架上含有生長因子的底物，并植入細胞［11］。經觀察，細胞可以在這些支架上生長，并形成錯綜復雜的網絡。但目前這項技術由于前期很難引導細胞定向生長，大多數(shù)應用于骨和軟骨的打印［12］。

1.2.1 海藻酸鈉水凝膠 海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇后的副產物，海藻酸鈉具有良好的生物相容性、生物降解性和pH敏感性［13］。海藻酸鈉水凝膠與其他聚合物相比，具有價格低、來源豐富、易塑形、更好的親水性、易于細胞吸附、營養(yǎng)物質易于滲透等特點。此外，海藻酸鈉還能促進巨噬細胞和人漿細胞的許多免疫學功能。因此，其具有較好的生物相容性和力學性能，是目前最有前景的生物材料之一。

1.2.2 明膠 明膠是膠原經溫和而不可逆的斷裂后的主要產物，化學性質穩(wěn)定。構成蛋白質的氨基酸大約有20種，而明膠就含有其中的18種，因此其還具有極高的生物相容性。明膠中缺少色氨酸，是膠原變性所得的產物，屬蛋白質大分子范疇。明膠微球廣泛用于生物材料，因為明膠和光引發(fā)劑的混合物通過暴露于紫外線的環(huán)境下，可以在擠出期間或之后實現(xiàn)快速交聯(lián)［14］。此外，明膠具有豐富的整合素結合基序，如纖連蛋白、波形蛋白和體外結合蛋白，它們通常參與細胞增殖過程。雖然光固化成型技術是用于高分辨率明膠生物材料打印，但擠出式生物打印技術則是明膠生物材料打印最廣泛應用的方法，并且其使用相對容易。

1.2.3 天然來源的人造支架 它是一系列的生物支架，可以用來承載視網膜3D打印的細胞，來源于體內的已有組織和體內元素的集合體。主要的天然支架有膠原薄膜、明膠支架、晶狀體囊、血漿、羊膜。天然的生物支架可以通過不同的物理、化學或酶學去細胞方法從細胞、組織和器官中獲得。天然生物支架具有良好的細胞相容性、力學特性以及生物降解性，有利于細胞生長、增殖、粘附及分化，可有效地降低其免疫源性，從而避免過敏反應和疾病傳播。

1.2.4 去細胞的細胞外基質 細胞外基質是細胞分泌到細胞外間充質中的蛋白質和多糖類大分子物質，具有高度組織有序的細胞外微環(huán)境，可形成結構復雜的網架，連接各個組織結構，對細胞的生長、發(fā)育以及細胞生理活動具有關鍵的調節(jié)作用，是細胞的外環(huán)境。但是，天然的細胞外基質是由多種蛋白質組成（主要分為膠原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、彈性蛋白4大類），由于結構復雜，不易在體外培養(yǎng)重構。通過不同物理、化學或酶學去細胞方法從細胞、組織和器官獲得天然的細胞外基質對這一難題的解決提供了新的有效解決途徑。去細胞化基質具有良好的細胞相容性、力學特性以及生物降解性，有利于細胞生長、增殖、粘附及分化，可有效地降低其免疫源性，從而避免過敏反應和疾病傳播。去細胞的細胞外基質是通過去除自身組織的細胞成分及一些小分子抗原，保留細胞外基質，是最為接近正常組織結構及微環(huán)境，理論上最為適合細胞的生長、分化及基質分泌，它最近被認為是生物打印應用中具有巨大潛力的材料。各種蛋白質、蛋白聚糖和糖蛋白的混合組成可以模仿原生組織的細胞基質的組成。在符合生理溫度的條件下，豐富的膠原蛋白的凝膠化促進了交聯(lián)的簡化，這是去細胞的細胞外基質在打印過程中所具有的特定優(yōu)勢［15］。

2 神經細胞打印

神經細胞分化程度高，再生能力非常有限，如何制造一個具有三維結構，同時保留細胞的神經元表型和基本的電生理學的神經細胞是目前神經組織工程的一大難題。

Hu等［16］用微型光刻裝置，使用3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的共聚物為原料，并從老鼠的脂肪組織中提取骨髓間充質干細胞培養(yǎng)，再加入FGF2因子，通過3D光固化的打印方式制備出仿生神經，植入大鼠坐骨神經損傷缺口中，28 d后觀察發(fā)現(xiàn)仿生神經修復效果與自體移植效果相近。Johnson等［17］使用神經干細胞、藻酸鹽、氯化鈣、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯、硅酮和明膠水凝膠作為3D打印材料，通過微擠壓的打印方式制備出3D打印的空心導管，植入到神經缺損的大鼠模型，經過12周后，實驗組與空白組進行步態(tài)運動分析，發(fā)現(xiàn)實驗組的抓力有明顯的提高，幾乎接近正常大鼠。Xu等［18］通過噴墨打印將NT2細胞和纖維蛋白凝膠逐層打印，制造除了具有神經結構和電生理特性的神經元，NT2神經元來自ATCC 3813555，培養(yǎng)液是10%的FBS，在37℃、5%CO2的標準條件下培養(yǎng)。實驗結果在光學顯微鏡下可以看到，細胞符合預先設計的圓形圖案，存活率74.2%±6.3%。電生理記錄顯示在組織內外有Na+、K+濃度的變化，并檢測到了10～85 mV的電壓變化。打印細胞的存活率和細胞功能都有了很大的提升。

3 神經節(jié)和神經纖維層打印

單個神經細胞的生存率和電生理功能可以得到保證，但是將一系列神經細胞成功打印并生成具有功能性的神經節(jié)甚至神經纖維層將大大增加打印的難度，這需要保證細胞本身具有一定的生長可控性。

Kador等［19］創(chuàng)造了一個可生物降解的電紡（ES）支架，用來引導視網膜神經節(jié)細胞（RGC）軸突的生長，模仿視網膜上的軸突定向，通過建立幾組不同的纖維結構來進行比較，如圖1所示。在電壓15 kV、流速2 mL/h、距離12 cm時具有最高的纖維走向一致性。利用這個支架，RGC的存活量明顯增加，并且在電生理特性上沒有顯著的變化。當對校準進行分析時，有81%的RGC被觀察到，在支架纖維上的軸突與視網膜移植的神經纖維層相比沒有差別。當移植到視網膜移植體上時，在ES支架上的RGC遵循宿主視網膜神經纖維的放射狀模式，而RGC則直接以隨機的模式移植了軸突。因此，使用這種支架作為一種細胞輸送裝置，是朝著使用細胞移植療法治療青光眼和其他視網膜退化疾病邁出的重要一步。

圖1 纖維方向一致性占比Fig.1 Fiber directional coherency

指導RGC軸突向視神經頭延伸是一個重要的難點，無論是在正常的發(fā)展過程中，還是在考慮RGC替代療法在傷害或疾病方面。在發(fā)育過程中，視網膜神經纖維層中的RGC軸突被定向到視神經頭，在視神經的頭部，可以通過分泌一些可溶性的引導因子引導神經細胞生長。Netrin-1是視網膜內的可溶性蛋白質，負責指導神經在大腦皮層分支和定位［20］。

為了保證在軸突引導過程中Netrin-1濃度對于化學固定所需的量是足夠的，采用一種隨機的、非梯度成形的方法進行固定。在-coated支架上培養(yǎng)Netrin-1，顯示了極化RGC數(shù)量的增加，即細胞只有一個軸突延伸。此外，在這些支架上培養(yǎng)的RGC也延長了軸突，這是因為在支架上的netrin-1集團形成了一個引導神經生長的濃度梯度。這些結果證明固定在支架上的Netrin-1的濃度足以引起生物反應。其次，有必要確定光啟動交聯(lián)的方法是否將使蛋白質的最高濃度達到最高。為了確定這一點，熒光標記的bsa-fitc蛋白通過兩種不同的紫外線活性交聯(lián)方式被固定。在第一種方法中，交聯(lián)劑最初是通過NHS的亞單位和可溶蛋白結合，然后通過光激活的二氮化單元進行交聯(lián)。在第二種方法中，這個過程被逆轉了uv-crosslinker在溶液中和bsa-fitc蛋白質進行反應，然后通過diazirine子單元與表面進行耦合。樣品用可溶性BSA-FITC蛋白質顯示熒光比，大幅提高耦合交聯(lián)的可控性。在此方法的固定化過程中觀察到的小點的熒光點，這可能代表了聚合的bsa-fitc的固定，而不是單一的單層細胞，這種方法是用一種化學方法或一種方法來形成的，因此在最初的可溶蛋白中固定不動蛋白，產生更大的固定蛋白濃度，可以使用這種方法來檢測軸突引導的生物學效應［21］。

4 干細胞打印

再生醫(yī)學領域需要可修復、可替換和再生能力強的細胞，通過干細胞培養(yǎng)可達體外制造組織和器官的目的。人類胚胎干細胞和誘導多能干細胞具有自我更新的能力。全能干細胞可以分化成所有的細胞類型有機體，而多能干細胞只能分化成為那些在成人中發(fā)現(xiàn)的細胞。Faulkner-Jones等［22］成功地通過噴墨打印機在方形網格的結構中滴入細胞懸液，在每個正方形的角落上各分配了一滴，并在已有液滴的通道上覆蓋了新的液滴，通過在同一位置增加液滴，改變位置濃度偏移量，達到精準打印的目的。同時采用閥瓣的方法，改良打印噴頭，降低打印時的溫度，提高細胞的生存率，并成功地打印出了一個細胞團。

雖然，干細胞組織團已經被成功打印出來，但是其分化方向仍是一個難點，如何在打印過程中控制其分化程度是一個關鍵問題，一旦一些分化程度較低或異分化的細胞進入人體，有可能會形成惡性腫瘤危害人體健康。因此，干細胞打印在應用于臨床的道路上，還有很多關鍵問題要解決。

5 結論

總結上面的論述，將ES細胞移植支架與熱噴墨3D細胞打印技術結合在一起，能夠精確定位在支架表面的RGC。為保證生存能力、電生理功能和神經病理，應結合各個指標最優(yōu)參數(shù)，可以將不同的媒介在不同的情況下進行測試。當在生長介質中含有腦源性神經營養(yǎng)因子和睫狀神經營養(yǎng)因子時，RGC維持生存和正常的電生理功能，并在ES支架上顯示徑向軸突生長。這些結果表明，在未來的視網膜模型或治療方法的設計中，3D打印技術可能與復雜的ES表面結合在一起。同時，細胞變異水平、分化程度也應引起人們的關注，保證生存率并不是需要解決的唯一問題，3D生物打印技術最終還應以服務臨床為第一要務。

最近的研究表明，某些哺乳動物的視網膜細胞、成年鼠RGC和神經膠質細胞可以成功地打印出來，而不會喪失生存能力和某些表型特征［23］。雖然視網膜細胞的3D打印技術取得了令人鼓舞的進展，但目前還沒有可以應用于人體的打印材料。生物材料既要考慮材料在打印前后的安全性、生物相容性、機械性能、降解性能等，又要考慮材料能產業(yè)化轉型。同時還有干細胞的來源、培養(yǎng)、誘導分化等諸多問題還有待于去解決。這也是接下來視網膜細胞3D打印所要解決的難題。隨著這些問題的解決，3D打印的視網膜才能真正應用于臨床。