禽流感病毒疫苗研究進(jìn)展

周賽賽，貢 嘎，錢雯嫻，王一飛，索朗斯珠

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

流行性感冒(簡稱流感)，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，是首個實(shí)施全球性監(jiān)測的傳染病[1]。流感病毒有甲（A）、乙（B）、丙（C）、?。―）型，A型流感病毒可分為18個HA亞型、11個NA亞型[2]，A型流感病毒因抗原變異、傳染性大、傳播快等因素，H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2等亞型流感易造成禽、豬、人等大范圍流行，與其他亞型流感相比流行更嚴(yán)重[3]；近期已在人的身上分離出H10N8、H9N2、H7N9、H7N2、H5N6、H5N1、H3N2、H1N1等多個亞型。OIE曾經(jīng)將高致病性禽流感列為A類動物疫病，我國也曾將高致病性禽流感列為一類動物疫病[4]。自20世紀(jì)以來，全球范圍內(nèi)爆發(fā)過6次大流感，分別是“西班牙流感”（1918-1919年）由H1N1亞型病毒引起，是人類歷史上最大的傳染病，幾乎同時傳遍歐洲、亞洲、北美洲，11個月死亡人數(shù)超過第一次世界大戰(zhàn)死亡人數(shù)的三倍（約5 000萬人死亡）；“亞洲流感”(1957-1958年)由H2N2亞型流感引起，首發(fā)于我國貴州省，8個月席卷全球，此次流感大流行導(dǎo)致至少100萬人失去生命；“香港流感”（1968-1969年）由A型H3N2流感引起，導(dǎo)致全球多于100萬人死亡；美國“豬流感”（1976-1977年）由豬H1N1亞型流感引起，導(dǎo)致200余人感染，1人死亡，因四分之一的美國人注射了疫苗，并未造成重大疫情；“俄羅斯流感”（1977-1978年）由1950年H1N1亞型流感的變異株引起，因老年人曾經(jīng)被原毒株感染過，擁有抵抗力和免疫力，此次青少年發(fā)病較高；“2009甲型流感”（2009-2010年）由新型A型H1N1流感病毒引起，導(dǎo)致近2萬人死亡[5,6]。在流感預(yù)防方面，除防止禽-豬-人流感病毒相互重組外，接種疫苗是目前最有效的方法；因流感病毒亞型較多、易突變，使各國學(xué)者在研制疫苗方面困難重重。本文將對國內(nèi)外不同性質(zhì)種類的流感病毒疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 禽流感病毒疫苗的原理及分類

疫苗是一種免疫保護(hù)性生物制品，經(jīng)機(jī)體識別后，結(jié)合機(jī)體后產(chǎn)生免疫機(jī)制，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，以此抵抗病原體的侵襲，并產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，或僅一種免疫方式，同時產(chǎn)生記憶性免疫細(xì)胞，建立起長期抗感染或減小毒力作用[7]。隨著各國學(xué)者對疫苗的研究，疫苗可分為治療疫苗和預(yù)防疫苗，根據(jù)性質(zhì)可分為禽流感病毒基因工程疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、減毒活疫苗、載體疫苗、通用疫苗等。

2 禽流感病毒疫苗的研發(fā)與應(yīng)用

2.1 禽流感病毒滅活疫苗

滅活疫苗是用甲醛或其他滅活劑滅活流感病毒雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液，再輔加佐劑制成。該滅活苗安全性高、免疫原性強(qiáng)、可制備多價苗、不出現(xiàn)返強(qiáng)和變異現(xiàn)象，是目前被廣泛應(yīng)用的疫苗，主要包括自然分離株和重組病毒研制的疫苗。自2003年起，農(nóng)業(yè)部指定研制了禽流感滅活疫苗，如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、揚(yáng)州大學(xué)生物制品研究開發(fā)中心等研發(fā)的二類禽流感滅活疫苗(H9亞型：SS株），得到農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，其作用安全有效。如今禽流感病毒滅活疫苗得到了有效的發(fā)展，如吳姣姣等[8]運(yùn)用重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活疫苗對商品肉雞進(jìn)行免疫保護(hù)，對免疫商品雞攻H5亞型和H7亞型禽流感強(qiáng)毒后，發(fā)現(xiàn)該滅活疫苗具有良好的免疫效果。章振華等[9]運(yùn)用雞新城疫(ND)-傳染性法氏囊病(IBD)-禽流感(AI)(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗對雛雞進(jìn)行免疫，結(jié)果對7～14 d雛雞免疫保護(hù)效果較好。Ali A等[10]運(yùn)用三價滅活油乳劑疫苗，對感染H5N8亞型高致病性禽流感病毒和毒性基因型VII新城疫病毒的SPF雞進(jìn)行免疫，該三價滅活苗具有顯著的臨床保護(hù)作用。

2.2 禽流感病毒基因工程疫苗

基因工程疫苗是將病原的基因片段連接到表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)染到細(xì)胞或真核、原核細(xì)胞微生物后得到的產(chǎn)物；或者將病原的毒力相關(guān)基因刪除掉，使成為不帶毒力相關(guān)基因的基因缺失苗?？煞譃榍萘鞲胁《净蚬こ虂唵挝灰呙?、重組活載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失或突變疫苗、合成肽疫苗等。

2.2.1 禽流感病毒基因工程活載體疫苗 基因工程活載體疫苗是用分子生物學(xué)技術(shù)來分離禽流感病毒抗原血凝素或神經(jīng)氨酸酶等基因，并將抗原插入新城疫病毒、痘病毒、皰疹病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等載體中，構(gòu)建表達(dá)抗原的重組病毒。2005年中國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)生產(chǎn)了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的世界首個二類禽流感-新城疫重組雞痘病毒載體活疫苗（H5亞型）[11]。因活載體疫苗可以是致病性微生物經(jīng)基因工程的方法修飾或去掉毒性基因以后，仍保持免疫原性，或是非致病性微生物經(jīng)基因工程方法使之?dāng)y帶并表達(dá)某種特定病原的抗原，產(chǎn)生免疫原性誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。國內(nèi)外學(xué)者Bertran K等[12]應(yīng)用H5亞型禽流感病毒重組新城疫疫苗和皰疹病毒疫苗，在接種后丙二醛可增強(qiáng)重組新城疫疫苗產(chǎn)生保護(hù)性免疫。Chang P等[13]將流感血凝素（HA）抗原插入鴨腸炎病毒基因組，可用于預(yù)防鴨流感病毒感染。雖然，活載體疫苗有很多優(yōu)勢，但活載體疫苗有可能保存一定活力、對保存和運(yùn)輸要求較高。

2.2.2 禽流感病毒樣顆粒疫苗 流感病毒樣顆粒疫苗是將流感病毒的抗原基因克隆到桿狀病毒系統(tǒng)內(nèi)，經(jīng)細(xì)胞表達(dá)后自組裝制成，可模擬病毒的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，且病毒樣顆粒不含病毒基因組和相關(guān)抗原，不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，無感染性，適用人群廣泛。為此國內(nèi)學(xué)者童彥軍[14]潘學(xué)等[15]利用H7N9、H9N2亞型禽流感病毒的HA、NA基因，建立了一種H7N9、H9N2亞型流感病毒顆粒疫苗制備的方法，小鼠實(shí)驗(yàn)表明對流感病毒效果良好且可產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)。

2.2.3 禽流感病毒基因工程亞單位疫苗 基因工程亞單位疫苗是通過基因工程方法取出編碼保護(hù)性抗原的基因，將基因和質(zhì)粒等載體重組，再轉(zhuǎn)化至受體菌或細(xì)胞中，獲得大量保護(hù)性肽段，然后再加入適量疫苗佐劑制成。亞單位疫苗所具有的優(yōu)點(diǎn)不僅安全性好，而且在刺激免疫保護(hù)力上具有很強(qiáng)的作用，對人類、動物和生態(tài)環(huán)境無潛在危害。我國學(xué)者范文輝等[16]周陳陳等[17]將H5、H7亞型流感病毒HA蛋白基因，經(jīng)篩選得到表達(dá)重組菌，獲得濃縮純化的目的蛋白，加佐劑研制成H5、H7亞型亞單位疫苗，經(jīng)免疫SPF雞試驗(yàn)，表明該疫苗具有良好免疫效果。Flood A等[18]利用冷凍干燥技術(shù)開發(fā)了兩種干燥型H1N1流感亞單位疫苗，經(jīng)免疫小鼠試驗(yàn)，表明該疫苗具有安全免疫原性。在佐劑的利用方面，Chen T H等[19]使用一種新型PELC/CPG佐劑開發(fā)重組H7N9亞單位疫苗，經(jīng)肌內(nèi)免疫BALB/C小鼠后，用這種佐劑配制的重組H7HA蛋白在血清中引發(fā)更高的IgG和病毒中和抗體，在脾臟中誘導(dǎo)更多T細(xì)胞分泌抗體和IFN-γ，并對小鼠提供更好的保護(hù)作用。為了優(yōu)化免疫方式Dhakal S等[20]用10種高度保守的B和T細(xì)胞表位肽的脂質(zhì)體納米顆粒（R＜200 nm）為基礎(chǔ)，用尿酸單鈉（MSU）晶體作為佐劑的亞單位流感疫苗，對H1N1亞型流感感染進(jìn)行保護(hù)性免疫保護(hù)，并以鼻內(nèi)噴霧的形式給豬接種疫苗，表明保護(hù)了豬免受流感引起的發(fā)熱和肺炎的損害。但是亞單位疫苗缺點(diǎn)在于免疫原性差、成本高、抗體持續(xù)時間短、有些甚至是半抗原、需要與蛋白載體偶聯(lián)后使用等。

2.2.4 禽流感病毒核酸疫苗 核酸疫苗是利用分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)等方法研制成的DNA疫苗或RNA疫苗；將可表達(dá)保護(hù)性免疫原基因(DNA或RNA)導(dǎo)入動物體細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)機(jī)體宿主細(xì)胞通過合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，核酸苗的研究以DNA疫苗為主，DNA疫苗因不需要任何化學(xué)載體而又叫裸疫苗。因DNA分子較穩(wěn)定、與傳統(tǒng)疫苗相比安全、不用加佐劑、產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)，我國學(xué)者賈云慧等[21]經(jīng)研究以歐亞類禽型H1N1豬流感病毒HA蛋白作為靶抗原，制備DNA疫苗，經(jīng)免疫BALB/c小鼠表明產(chǎn)生高水平的HI和VN抗體，對同源歐亞類禽型H1N1豬流感的感染有完全保護(hù)作用，對異源pdm H1N1/2009豬流感的感染也有叉免疫保護(hù)效果。Yao Y等[22]研究了H1N1亞型流感病毒M2蛋白，N端胞外區(qū)為靶抗原，研發(fā)了M2E DNA疫苗，經(jīng)免疫小鼠發(fā)現(xiàn)這兩種疫苗可保護(hù)人類免受H1N1亞型病毒的致命感染。RNA疫苗可分成兩類型，一種是常規(guī)下的mRNA疫苗，一種是自我擴(kuò)增的mRNA疫苗。國外學(xué)者Norbert P等[23]使用核苷修飾和純化的編碼全長流感病毒HA的mRNA，該病毒以脂質(zhì)納米粒形式配制，經(jīng)免疫小鼠、兔子和雪貂，是一種有效、具有廣泛保護(hù)作用的流感病毒候選疫苗，表明在注射部位和淋巴結(jié)中天然免疫反應(yīng)的強(qiáng)烈激活，mRNA疫苗可以與滅活病毒的疫苗競爭，甚至在功能性抗體和T細(xì)胞反應(yīng)方面更優(yōu)越。經(jīng)過我國科研工作者的不斷努力，2018年中國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所等單位的首個一類禽流感DNA疫苗（H5亞型，pH5-GD）的生產(chǎn)。

2.3 禽流感病毒減毒活疫苗

減毒活疫苗是禽流感病毒經(jīng)處理后，毒性亞單位結(jié)構(gòu)改變，但結(jié)合亞單位的活性保持不變，使疫苗保持了抗原性且達(dá)到減毒的目的。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，因減毒活疫苗與滅活疫苗相比可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫、在機(jī)體內(nèi)長時間起作用、而只需接種一次、無需加佐劑、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者劉梅等[24]Mamerow S等[25]運(yùn)用禽流感病毒NS1基因缺失或突變的減毒活疫苗，對豬、小鼠或蛋雞進(jìn)行免疫免疫，結(jié)果表明小鼠和豬既沒有出現(xiàn)臨床癥狀且對雞有良好保護(hù)，也沒有檢測到病毒復(fù)制。Wan Z等[26]利用A型H3N2和H1N1流感病毒和兩個B型流感病毒抗原譜系，制成的競爭性減毒活流感病毒疫苗配方，可提供有效的保護(hù)。但減毒活疫苗缺點(diǎn)是有一定殘余毒力、可能有“毒力返祖”現(xiàn)象、產(chǎn)品的分析評估困難、保存和運(yùn)輸?shù)葪l件高等；因此，目前我國還未有被批準(zhǔn)的禽流感病毒減毒活疫苗。

2.4 禽流感病毒通用疫苗

流感通用疫苗原理是破壞流感病毒各亞型共有的蛋白，蛋白為HA、M2，因蛋白幾乎未發(fā)生變異，為研發(fā)提供了充分的理論基礎(chǔ)，該疫苗對病毒各亞型都具有一定的交叉保護(hù)性，流感病毒防控方面具有重要意義。因通用疫苗是人們最想得到的理想疫苗，僅有個別國外學(xué)者對其研究，如Rowell J等[27]利用A型流感病毒相對保守的NP和M2抗原，研究了一種通用流感疫苗，該疫苗經(jīng)小鼠鼻內(nèi)給藥試驗(yàn)，該疫苗對有不同呼吸道感染史的人群也有效。Sun W等[28]利用A、B型流感病毒，將A型流感血凝素的相應(yīng)序列替換B型流感血凝素的主要抗原位點(diǎn)，產(chǎn)生鑲嵌B血凝素，并將其表達(dá)可溶性三聚體蛋白，研制了一種新的基于鑲嵌血凝素的通用B型流感病毒疫苗，結(jié)果該疫苗對同源和異源性B型流感病毒株產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。通用禽流感疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于此疫苗可預(yù)防所有常見流感，保護(hù)時間長等。

3 小結(jié)和展望

自20世紀(jì)30年代，各國學(xué)者開始研制流感病毒疫苗，在過去幾十年中，隨著新技術(shù)的發(fā)展和各國學(xué)者對流感病毒研究的不斷深入，從最初2003年批準(zhǔn)的單價禽流感病毒滅活苗到2018年基因工程DNA疫苗的批準(zhǔn)，禽流感病毒疫苗已經(jīng)獲得較快的發(fā)展。通過對中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的公告統(tǒng)計，自2003年至2018年我國部門陸續(xù)批準(zhǔn)了H5和H9亞型不同毒株的單價和二價禽流感滅活疫苗；在2003年我國首次出現(xiàn)新城疫、禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗；隨后十年間我國不斷出現(xiàn)三聯(lián)、四聯(lián)重組滅活疫苗；直到2014年后我國未見四聯(lián)苗的批準(zhǔn)；我國科研工作者開始著眼于單價滅活疫苗、二價滅活疫苗、二聯(lián)和三聯(lián)滅活疫苗的研發(fā)，如我國的三聯(lián)苗，通過對肉仔雞免疫雞新城疫+傳染性支氣管炎+禽流感三聯(lián)滅活疫苗，對H9亞型禽流感的免疫效果達(dá)100%；隨著細(xì)胞源禽流感病毒在質(zhì)量、穩(wěn)定性、含量和純凈性等方面突出的優(yōu)點(diǎn)，近兩年我國對（H5+H7）亞型禽流感病毒重組二價滅活疫苗毒株也傾向于用細(xì)胞源毒株。

由于流感病毒亞型較多，基因重組等問題，雖已經(jīng)研發(fā)出各種流感病毒疫苗，但疫苗在臨床應(yīng)用中仍然有較多缺點(diǎn)，為此各國學(xué)者也在積極研發(fā)高效、安全、低成本的新型流感病毒疫苗，新型流感病毒疫苗將在人類防控流感過程中發(fā)揮重要作用。通用疫苗是人們期盼多年的疫苗，但提高該苗對變異株的廣譜能力是一個難題，從目前研究結(jié)果來看，它還很難進(jìn)入實(shí)用，隨著疫苗生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，相信在不久的將來會研究出安全性好、免疫原性高的流感疫苗。