一例馬匹發(fā)生疑似飼料生物毒素中毒的診斷

潘 紅，羅斌漢，羅千慧，趙睿明，孫雨琪，岑曼益，侯俊達，藺國珍

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

2018年4月青海某地養(yǎng)殖戶的一匹黑馬發(fā)生突然死亡，病發(fā)突然，畜主懷疑是由于飼喂了倉庫中的小麥引起的。據(jù)現(xiàn)場解剖變化為心臟淤血水腫，肝臟組織變性，切面呈土黃色，肺臟淤血水腫。由于該病原因不明、爭議較大，先后送檢到有關(guān)部門進行診斷，還無法對馬匹的死亡原因做出確切的診斷。最后畜主將當天購買和死亡馬匹所食的飼料送來進行實驗室檢測，現(xiàn)將檢測結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 送檢樣品

馬槽中飼喂剩下的小麥，倉庫中保存的小麥，塑料袋密封保存經(jīng)運輸送到實驗室4℃保存?zhèn)溆茫挥苤锌h市場購買干凈的、無異常的食用小麥。

1.2 試驗動物

法國伊拉兔（獺兔）12只，體重為1.8～3.75 kg，健康狀況良好。小白鼠24只，體重18～22 g，健康狀況良好，采購自蘭州獸醫(yī)研究所。對所有試驗的動物提前7 d飼喂觀察，證明健康無病后作為試驗動物備用。

1.3 家兔飼喂試驗

將12只健康的家兔分為三組，每組4只，其分組如下：第1組，即組Ⅰ，飼喂馬槽中飼喂剩下可疑小麥，第2組，即組Ⅱ，飼喂倉庫中的小麥，對照組則飼喂購自榆中縣市場小麥。以上3組家兔每天檢測其體溫變化，每只每日飼喂小麥50 g，其余飼料為同一類型干凈的青干草，在相同條件下籠中隔離飼養(yǎng)，自由飲水，保持籠中干凈清潔，每日觀察精神食欲和死亡等情況。如有死亡情況，觀察其組織臟器有無病理變化。

1.4 病原微生物學檢查及動物接種試驗

選取1.3中最先死亡家兔的肝臟觸片，并對觸片進行革蘭氏染色和瑞特氏染色，在光學顯微鏡下觀察有無細菌。將死亡兔肝臟、心血分別涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察有無菌感染。如果有菌生長，挑取平板中單個菌落分別接種于營養(yǎng)瓊脂斜面進行純培養(yǎng)，再將純培養(yǎng)物接種于10%的血清營養(yǎng)肉湯振搖培養(yǎng)，200 r/min，在37 ℃培養(yǎng)24 h，對試管中純培養(yǎng)的菌落分別進行革蘭氏染色和瑞特氏染色，并在光學顯微鏡下觀察。

用死亡兔肝臟中純分離出來的菌株的肉湯培養(yǎng)物對小鼠進行腹腔注射，每株菌各用4只小白鼠，每只0.5 ml，同時設(shè)4只小白鼠作為對照組，用無菌的肉湯每只腹腔注射0.5 ml。每天對小鼠的情況進行觀察，持續(xù)觀察5 d。

1.5 飼料中疑似含有生物毒素的動物試驗

將來源相同，年齡、體重基本相同的10只健康小白鼠分為兩組，每組5只。試驗組即將馬槽中飼喂剩余的飼料用1：5的PBS在旋渦振蕩儀振蕩5 min后，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液加入雙抗至最終濃度為1 000 U/ml，在37 ℃培養(yǎng)箱中作用1 h，給試驗組小白鼠尾靜脈注射0.8 ml；對于條件相同對照組小白鼠，用新購買的小麥，使用與試驗組相同的方法獲取上清液，分別對小白鼠尾靜脈注射0.8 ml。兩組小白鼠在籠中隔離飼養(yǎng)，飼喂方法和飲水相同，每天觀察和記錄其精神食欲及死亡的情況，連續(xù)觀察7 d。

2 結(jié)果

2.1 家兔飼喂試驗

在家兔飼喂試驗期間，三組家兔觀察的情況見表1。三組家兔的體溫未見升高，組Ⅰ中家兔3 d內(nèi)的精神狀況良好，食欲正常，從第4 d起組Ⅰ的精神食欲狀況開始降低，且有一只的食欲廢絕，在第5 d的時候1號家兔死亡，其他3只家兔精神沉郁，食欲廢絕，第7 d時2號家兔死亡，觀察至第8 d，組Ⅰ中的家兔全部死亡。在8 d內(nèi)組Ⅱ和對照組的家兔都精神狀況良好，沒有出現(xiàn)一例死亡。

表1 家兔精神食欲和死亡情況

死亡的4只家兔經(jīng)尸體剖檢，眼觀表現(xiàn)如下：嘴唇發(fā)青，肝臟呈藍紫色，淤血，質(zhì)地脆，切開肝門靜脈，血液凝血不良；膽囊腫大；有一只家兔的脾臟腫大；胃內(nèi)容物呈液性鼓脹，內(nèi)容物稀薄，部分內(nèi)膜脫落；十二指腸下端充血、出血，腸壁變??；心肌松軟，右心擴張松軟，冠狀血管淤血；肺臟淤血，膈葉有壞死灶；脾臟無明顯變化；腸系膜淋巴結(jié)有兩只腫脹；膀胱有一只有積液；氣管和喉管黏膜充血。

2.2 死亡家兔病原微生物檢查及致病性試驗

最先死亡的1號和2號兔的肝臟觸片經(jīng)染色后，如圖1所示，鏡檢發(fā)現(xiàn)疑似有少量的瑞特氏染色呈藍紫色的桿菌。兩只死亡家兔的肝臟、心血培養(yǎng)中在平板上長出灰白色中等大小的菌落，表面隆起，邊緣整齊，較為光滑，在10%的血清營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察渾濁，底部有沉淀。肉湯中的培養(yǎng)物發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性形態(tài)一致的桿菌（圖2）。

用死亡兔肝臟中純分離出來的肉湯培養(yǎng)物腹腔接種小白鼠后，試驗組小白鼠和對照組小白鼠均未見死亡。

圖1 肝臟觸片的細菌（瑞特氏染色，×1000）

2.3 飼料中生物毒素的初步檢測

飼料上清液對小白鼠試驗結(jié)果為：試驗組即馬槽飼喂剩余的小麥脫洗下的上清液，5只小白鼠經(jīng)一周的觀察，3只死亡（死亡率為60%），對照組未發(fā)現(xiàn)死亡。

圖2 肉湯培養(yǎng)物中的細菌（革蘭氏染色，×1000）

3 討論

據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)對于馬屬動物中毒的研究相對較少，較多在飼喂了含有發(fā)霉的糧食，或誤食、多食含有毒素的食物導致出現(xiàn)中毒及死亡[1-7]。劉志強報道了新疆奇臺縣馬的死亡病例，在牧民家中，馬匹突然發(fā)病，倒地身亡。根據(jù)臨床癥狀和解剖診斷，得知是牧民給馬飼喂了霉變的玉米導致的[8]。還有報道稱馬在誤食中藥蓖麻籽后，導致碳水化合物代謝紊亂產(chǎn)生中毒死亡現(xiàn)象[9]。在本研究中，將馬槽中的小麥飼喂實驗動物家兔后，家兔全部死亡；飼喂小麥的洗脫液在尾部靜脈注射小鼠后，死亡率為60%，而且對照組的新鮮小麥無一例出現(xiàn)死亡，表明馬是由于飼喂了含有不明毒素的小麥而導致死亡的。實驗中的家兔的體溫正常，沒有出現(xiàn)升高，死亡后的家兔病理解剖學檢查有病變，但微生物分離培養(yǎng)及分離菌的小白鼠致病性試驗尚未觀察到所分離的菌有致病性，表明其不是導致動物死亡的致病菌。在肝臟觸片和接種過程中，也可能由于操作的失誤，而使檢查中出現(xiàn)細菌。而且動物一般在細菌病毒等感染后，其體溫會出現(xiàn)升高，根據(jù)這一特點推斷，馬槽中飼喂的飼料中不含具有致病性的細菌。據(jù)蔡葵蒸等報道，家兔在飼喂了含有變質(zhì)肉骨粉的飼料時出現(xiàn)爆發(fā)性死亡，變質(zhì)的肉骨粉中含有肉毒梭菌，其增殖后產(chǎn)生的毒素引發(fā)了家兔的死亡[10]。對飼喂的飼料觀察和詢問畜主發(fā)現(xiàn)，馬當天飼喂的小麥是從倉庫中袋子的下層取出，其出現(xiàn)了變質(zhì)，而且小麥周圍沒有其他藥物和毒素出現(xiàn)，其他袋中的小麥在動物實驗中沒有出現(xiàn)動物死亡，認為青海地區(qū)馬的死亡是由于飼喂了含有疑似生物毒素的小麥所致，在糧食保存時，倉庫中悶熱，封閉，雜亂潮濕的環(huán)境會導致小麥發(fā)生變質(zhì)，在變質(zhì)過程中產(chǎn)生的未知毒素是導致馬死亡的關(guān)鍵因素。因此，在飼料的保存過程中，要注重倉庫環(huán)境的干凈整潔，對飼料合理保存，在變質(zhì)等情況發(fā)生時要及時處理。