應(yīng)用噬菌體治療畜禽細(xì)菌性腹瀉的研究進(jìn)展

王通，李曉宇,2,4，王麗麗,2,4，李淑英，徐永平.*

(1 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院, 大連 116024；2 動物性食品安全保障技術(shù)教育部工程研究中心, 大連 116600；3 大連賽姆生物工程技術(shù)公司, 大連 116620；4 遼寧省大連賽姆噬菌體應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，大連 116600)

1 引言

養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展關(guān)系到每個人的飲食安全與身體健康。在我國，規(guī)模化養(yǎng)殖已成為畜禽養(yǎng)殖的最主要形式，這也增加了畜禽疾病傳播的風(fēng)險。其中，細(xì)菌性疾病是影響?zhàn)B殖業(yè)發(fā)展的主要問題之一，每年投入人力、藥物等成本巨大，為養(yǎng)殖戶帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。

畜禽腹瀉是養(yǎng)殖過程中的一種常見病癥，通常與腸道疾病或其他全身性疾病相關(guān)。除腸道細(xì)菌感染造成的腹瀉之外，常見病因還有動物中毒、寄生蟲感染、營養(yǎng)問題、應(yīng)激及神經(jīng)性因素等。治療畜禽腹瀉要對癥下藥，根據(jù)病因找到最合適的治療方法。其中由大腸埃希菌(Escherichia coli)、沙門菌(Salmonella)等病原菌造成腸道疾病引起的腹瀉最為常見[1]。養(yǎng)殖過程中飼料加工、籠舍清理、溫度調(diào)節(jié)等方面處理不當(dāng)都可為病菌傳播提供條件。動物染病后發(fā)生腹瀉常伴有食欲不振、生長緩慢等問題，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡。疾病傳播可導(dǎo)致減產(chǎn)，對畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。常用的抗生素療法存在藥物殘留、致病菌出現(xiàn)耐藥性等諸多弊端，因此找到一種合適的替代療法已經(jīng)迫在眉睫[2]。噬菌體療法憑借無殘留、成本低等多方面優(yōu)勢成為一種潛在的替代選擇，本文就噬菌體防治畜禽腹瀉研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

2 噬菌體簡介

噬菌體(bacteriophage)于1915年由英國細(xì)菌學(xué)家Twort (1877-1950)和加拿大生物學(xué)家Félix d'Herelle發(fā)現(xiàn)，是對一類能感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱[3]。噬菌體能特異性結(jié)合、裂解宿主，根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，可將其分為溫和噬菌體和裂解性噬菌體兩大類。裂解性噬菌體增殖周期短，每次裂解宿主都可產(chǎn)生多達(dá)200個子代噬菌體，具有極高的增殖效率[4]。利用這種裂解效應(yīng)來特異性殺滅病原菌，具有極高的精確性，治療效果也十分顯著[5]。一般而言，致病菌對噬菌體的抗性突變率很低，頻率約為10-7，而對抗生素的抗性突變頻率為10-6，噬菌體可以在病原菌產(chǎn)生抗性之前將其有效殺滅。此外，噬菌體療法不存在藥物殘留問題，也不會污染畜禽產(chǎn)品[6]。憑借其多方面優(yōu)勢，噬菌體成為一種抗生素理想的替代品。

3 噬菌體治療畜禽腹瀉

3.1 防治大腸埃希菌引起的腹瀉

大腸埃希菌屬革蘭陰性細(xì)菌，廣泛分布于人畜的腸道環(huán)境里。多數(shù)大腸埃希菌是非致病性的，但部分致病性大腸埃希菌能夠引起腸道內(nèi)外部感染。致病性大腸埃希菌是一類常見的、能夠引起畜禽腸道疾病的病原菌。研究人員根據(jù)致病機(jī)理的不同將致瀉性大腸埃希菌主要分為6類：產(chǎn)腸毒性大腸埃希菌(EnterotoxigenicE.coli, ETEC)、腸出血性大腸埃希菌(EnteropathogenicE.coli, EHEC)、腸粘附性大腸埃希菌(EnteroadhesiveE.coli, EAEC)、腸致病性大腸埃希菌(EnteropathogenicE.coli, EPEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EnteroinvasiveE.coli, EIEC)和擴(kuò)散粘附性大腸埃希菌(Diffusely adherent E.coli, DAEC)。作者所在團(tuán)隊(付麗娜，2017)對于各類致病性的大腸埃希菌的噬菌體治療進(jìn)行過研究[7]，并成功分離出了豬源腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌噬菌體。牛羊等反芻動物是食源性大腸埃希菌感染的重災(zāi)區(qū)，而幼年動物比成年動物更易受到感染。幼畜中最常見的大腸埃希菌病是由非侵入性腸毒素大腸埃希菌(ETEC)引起的，也是腹瀉的主要原因之一?；疾?yán)重時會伴有出血性腹瀉等癥狀，是導(dǎo)致幼畜死亡的主要威脅之一。

國內(nèi)外對利用噬菌體治療致病性大腸埃希菌引起的畜禽腸道疾病都進(jìn)行了廣泛的研究，作者所在團(tuán)隊(牛冬燕，2009)對應(yīng)用噬菌體控制牛及其飼養(yǎng)環(huán)境中大腸埃希菌O157:H7進(jìn)行充分研究，利用wV7、wV8、rV5和wV11共四種噬菌體對牛場中大腸埃希菌O157:H7進(jìn)行裂解，研究表明，口服給藥的四株噬菌體可以有效裂解大部分受檢菌株，不同飼養(yǎng)場的菌株對噬菌體wV8表現(xiàn)出不同的易感性，發(fā)現(xiàn)噬菌體rV5、wV11和wV8的易感性受其噬菌體表型和PFGE基因型影響，而噬菌體wV7的宿主譜和裂解能力不受菌株的噬菌體表型和PFGE基因型的影響，能夠有效地裂解所有受檢分離株[8]。Callaway等[9]從飼育場的環(huán)境中篩選得到了針對大腸埃希菌O157:H7的噬菌體，利用其治療綿羊的大腸埃希菌感染，24h后發(fā)現(xiàn)羊體內(nèi)和糞便中的大腸埃希菌數(shù)量顯著下降。Cha等[10]檢測特異性噬菌體CJ12治療ETEC感染的效果，他們將噬菌體混入豬飼料中給藥，兩個實驗組的豬糞便中的ETEC數(shù)量減少了63.92%和60.73%。Rozema等[11]分別通過口服和注射給藥的方式利用噬菌體治療大腸埃希菌O157，都取得了良好的治療效果。Denou等[12]利用T4噬菌體對感染大腸埃希菌O157:H7的小鼠進(jìn)行試驗，治療效果過十分顯著，且未造成任何不良反應(yīng)。Li等[13]利用噬菌體治療大腸埃希菌造成的腹瀉，將大腸埃希菌接種到小鼠體內(nèi)，經(jīng)噬菌體治療三周后，所有小鼠全部存活。利用噬菌體治療染病的肉雞，顯著的降低了肉雞的死亡率，且肉雞增重明顯。飼料的利用率提高了11%，飼料的消耗量也大幅降低。說明在實際生產(chǎn)過程中，利用噬菌體治療大腸埃希菌引發(fā)的腸道疾病，能有效地降低養(yǎng)殖成本。Lau等[14]利用噬菌體EC1治療大腸埃希菌O78：K80導(dǎo)致的肉雞腹瀉，在三周的試驗過后，肉雞死亡率從83.3%下降至13.3%。Huff等[15]利用噬菌體治療大腸埃希菌導(dǎo)致的肉雞腹瀉，實驗將感染大腸埃希菌后不進(jìn)行處理的肉雞與應(yīng)用噬菌體進(jìn)行治療的肉雞進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，未經(jīng)噬菌體治療的一組肉雞死亡率高達(dá)47%，而應(yīng)用噬菌體進(jìn)行治療的一組，其死亡率降低至13%。證明噬菌體在治療家禽大腸埃希菌腹瀉上效果十分顯著。El-Gohary等[16]將噬菌體噴灑到褥草上來抑制大腸埃希菌的擴(kuò)散，實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過噬菌體處理的肉雞受大腸埃希菌影響極低，生長迅速，且其食用安全性未受到影響。

3.2 防治沙門菌引起的腹瀉

沙門菌是一類常見的革蘭陰性菌，在自然界中分布十分廣泛，營養(yǎng)需求較低，種類繁多，目前已檢測出沙門菌血清型2500余種[17]。沙門菌作為一類常見的食源性致病菌，通常能夠誘發(fā)腸道疾病，養(yǎng)殖業(yè)中主要感染對象為家禽，除造成畜禽患病以外，還可能通過污染動物制品感染人類，嚴(yán)重時可導(dǎo)致食物中毒。家禽感染后，種蛋的孵化率、育雛率和成活率會都受到嚴(yán)重影響，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

常見的沙門菌病有雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒等。其中最為常見的是雞白痢，雞白痢是雛雞的一種急性、敗血性傳染病[18]。2周齡以內(nèi)的雛雞發(fā)病率和死亡率都很高，成年雞感染沙門菌則多表現(xiàn)為慢性癥狀。沙門菌可以進(jìn)行水平傳播也可以進(jìn)行垂直傳播，大多通過帶菌種雞垂直傳播給雛雞，也可以通過糞便水平傳播。如果孵化了帶菌的雞蛋，雛雞出殼1周內(nèi)就可能發(fā)病死亡，對于雛雞的成活率影響極大。育成期雖有感染，但一般無明顯臨床癥狀，種雞場一旦被污染，很難根除。

研究表明利用噬菌體治療家禽沙門菌感染導(dǎo)致的腹瀉效果十分顯著，作者所在團(tuán)隊成員(袁玉玉，2016)[19]曾對應(yīng)用噬菌體治療沙門菌導(dǎo)致的雞白痢進(jìn)行過研究，分離得到強裂解性噬菌體，通過滴眼和口服方式給藥，分組實驗中治愈率最高可達(dá)80%。Atterbury[20]等研究發(fā)現(xiàn)，利用高濃度的噬菌體制劑能有效的減少肉雞腸道沙門菌和鼠傷寒沙門菌在肉雞腸道內(nèi)的數(shù)量。且盡管會出現(xiàn)部分噬菌體抗性突變菌，但在體內(nèi)和體外的實驗中均發(fā)現(xiàn)其抗性持續(xù)時間較短，因而總體上噬菌體治療效果十分顯著。另一項研究表明，向蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加針對雞沙門菌、雞白痢沙門菌、鼠沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、德比沙門菌和金黃色葡萄球菌的混合噬菌體。可使蛋雞盲腸內(nèi)容物內(nèi)沙門菌數(shù)量直線下降，且未觀察到噬菌體作為飼料添加劑對蛋雞的產(chǎn)蛋性能的不良影響。此外，噬菌體還能減弱種蛋孵化過程中的沙門菌感染[21]。Henriques等[22]向孵化過程中感染沙門菌的蛋殼表面噴灑噬菌體后發(fā)現(xiàn)，噴灑組中孵化的雛雞與未噴灑組中相比關(guān)節(jié)炎癥狀明顯減輕，且8d后癥狀消失，與未感染沙門菌種蛋孵化的雛雞狀態(tài)相似。這說明噬菌體可以阻斷沙門菌的垂直傳播。

3.3 治療途徑

噬菌體是替代抗生素的理想選擇，而在畜禽大規(guī)模養(yǎng)殖過程中，出于成本等多方面考慮，將噬菌體制劑混入飼料中給藥是最為常見的方法[23]。研究中發(fā)現(xiàn)將噬菌體混入飼料中直接飼喂的治療效果并不理想，其原因在于通過消化道到達(dá)胃腸道過程中，噬菌體可能會受到飼料成分、各類雜質(zhì)、胃酸等外界條件的影響而導(dǎo)致其活性下降甚至喪失活性[24]。因此，要保證口服噬菌體治療動物胃腸道疾病的療效，就必須找到一種能保護(hù)噬菌體不受到破壞，在給藥過程中保持噬菌體活性的方法[25]。作者所在團(tuán)隊(馬永生，2011)開發(fā)了一種噬菌體口服微球制劑，利用海藻酸鈉、乳清蛋白為載體材料，利用二甲金屬陽離子鈣為固化劑制成微球制劑能夠有效地保護(hù)噬菌體免受胃酸和消化酶作用而遭到破壞。使得噬菌體可以到達(dá)動物腸道并有效地釋放，直達(dá)病灶充分發(fā)揮作用，保證了噬菌體治療的快速、高效[26]。Colom等[27]利用脂質(zhì)體包被噬菌體，治療家禽沙門菌感染，72h后膠囊化給藥的噬菌體在動物體內(nèi)仍存在38.1%，而未經(jīng)包被給藥的噬菌體，只剩9.5%，其對噬菌體的保護(hù)作用突出。Kaikabo等利用殼聚糖制成包被噬菌體的微粒治療肉雞大腸埃希菌感染，肉雞死亡率從58.33% 降低至16.7%，噬菌體的保存率從42%提高至83.33%，充分說明口服給藥過程中對噬菌體進(jìn)行包裝加工的重要性。這種新型的噬菌體制劑為噬菌體療法在畜牧業(yè)中的推廣應(yīng)用開辟了的道路。

4 結(jié)論與展望

抗生素耐藥性已經(jīng)成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的世界性問題，開發(fā)新抗生素的成本高、周期長等多方面問題都讓人們不得不加緊尋找一種合適的替代品[28]。國內(nèi)外的大量實驗證明，利用噬菌體來防治由細(xì)菌感染造成的畜禽腹瀉是安全有效的[29]。噬菌體在自然界含量豐富，分布廣泛。與傳統(tǒng)的藥品相比，噬菌體的開發(fā)周期更短，成本低廉。通過簡單的篩選、離心去除細(xì)菌碎片即可得到相對純凈的噬菌體儲存運輸條件寬松，一般常溫即可。利用噬菌體治療疾病的常見方法，除將噬菌體直接作為抗菌劑，也可將噬菌體編碼的裂解酶作為抗菌劑以及從噬菌體的裂解機(jī)制出發(fā)，尋找新的藥物靶點，通過多種途徑發(fā)揮噬菌體的功能，使其效用最大化。噬菌體所具有的高度特異性使其在發(fā)揮作用的同時不會對機(jī)體內(nèi)的固有菌群產(chǎn)生影響，也不會干擾機(jī)體的正常代謝。相較于抗生素，病菌對噬菌體產(chǎn)生抗藥性的幾率非常低，因而將噬菌體制劑產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用到治療畜禽腹瀉以及其他的常見疾病中潛力十分巨大。根據(jù)近年來的經(jīng)驗以及應(yīng)用方面的成果，越來越多的科學(xué)家和企業(yè)都相信，噬菌體用于替代抗生素治療細(xì)菌性疾病的應(yīng)用將會取得巨大的成功。此外，當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)，各種新的培養(yǎng)檢測方法也層出不窮，在此基礎(chǔ)上人們對噬菌體的生物學(xué)特性以及噬菌體與其宿主菌的相互作用機(jī)制也有了更深層的研究，這樣更有利于研制出新的噬菌體制劑及為噬菌體治療提出科學(xué)可行的策略，預(yù)防和治療細(xì)菌感染。

雖然噬菌體療法有諸多優(yōu)勢，但在其實際應(yīng)用過程仍存在諸多不足，例如噬菌體裂解譜過窄、裂解病菌后其釋放內(nèi)毒素等都影響了噬菌體療法的進(jìn)一步推廣。因而篩選廣譜噬菌體、根據(jù)實際需要通過基因工程技術(shù)對現(xiàn)有噬菌體進(jìn)行改造成為了其發(fā)展的趨勢，由于噬菌體是通過其內(nèi)部含有的多種酶類發(fā)揮作用，因此對其所含的酶加以提純利用也是噬菌體研究發(fā)展的趨勢之一。隨著對噬菌體分子機(jī)理層面研究的不斷深入，相信在不遠(yuǎn)的將來，噬菌體療法會為養(yǎng)殖業(yè)乃至人類的健康做出更大的貢獻(xiàn)。